遺伝子組み換え乳酸菌の作製とその腎不全治療への応用

转基因乳酸菌的生产及其在肾衰竭治疗中的应用

• 批准号: 11877174
• 负责人: 丹羽 利充
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11877174/
• 关键词: 遺伝子組み替え; 乳酸菌; ウレアーゼ; 腎不全

乳酸菌の発現ベクター(pHS2010,pH2515,pH2311)のクローニング・サイトにKlebsiella aerogensのウレアーゼ遺伝子を組み込み、それらをcompetent化されたJM109(大腸菌)をtransformし、ウレアーゼ活性assay用LB plate(尿素とフェノールレッドが含まれており、ウレアーゼの活性が存在すると、尿素がアンモニアに分解され、アルカリ性となり、コロニーが赤色になる。)でウレアーゼ活性陽性クローン(US-pHS2010,US-pHS2515,US-pHS2311)をクローニングし、それぞれを大量培養後、各プラスミドの精製を昨年度に行った。それらを乳酸菌の一種、Lactobacillus caseiに既報のelectroporationによって導入した。乳酸菌のウレアーゼ活性はウレアーゼ活性assay用MRS plate(上記と同様の原理を乳酸菌用培地に応用したもの)で検討し、陽性コロニーを同定した。上記の操作で得られたウレアーゼ活性陽性の各クローンを、糖源にLactoseを用いた Rogasa's mediumに植菌した。37度の好気条件で培養を開始し、培地のOD600が0.6に達したところで、培地中に尿素を添加する。添加後、経時的に培地を少量採取して、培地中の尿素濃度及びアンモニア濃度を測定し、各乳酸菌のウレアーゼ活性を定量した。その結果、ウレアーゼの発現が確認された乳酸菌クローンのウレアーゼ活性は増加していた。腎不全ラットに対してウレアーゼ発現乳酸菌を投与して血中尿素窒素への効果を検討するため、腎不全ラットを作成した。

Lactic acid bacteria の 発 now ベ ク タ ー (pHS2010 pH2515, pH2311) の ク ロ ー ニ ン グ · サ イ ト に Klebsiella Aerogens の ウ レ ア ー ゼ posthumous son 伝 を group み 込 み, そ れ ら を competent change さ れ た JM109 (coliform) を transform し, ウ レ ア ー ゼ activity assay with LB Plate (urea と フ ェ ノ ー ル レ ッ ド が containing ま れ て お り, ウ レ ア ー ゼ の active が exist す る と, urea が ア ン モ ニ ア に decomposition さ れ, ア ル カ リ sex と な り, コ ロ ニ ー が red に な る.) で ウ レ ア ー ゼ active positive ク ロ ー ン (US - pHS2010, US - pHS2515, US - pHS2311) を ク ロ ー ニ ン グ し, そ れ ぞ れ を after a lot of training, each プ ラ ス ミ ド の refined を yesterday annual line に っ た. Youdaoplaceholder0 lactic acid bacteria <e:1>, Lactobacillus caseiに report <s:1> electroporationによって introduction た た. Lactic acid bacteria の ウ レ ア ー ゼ active は ウ レ ア ー ゼ activity assay with MRS plate (written と with others の principle を lactic acid bacteria with the petty に 応 with し た も の) で beg し 検, positive コ ロ ニ ー を with fixed し た. Written の で operation to ら れ た ウ レ ア ー ゼ active positive の each ク ロ ー ン を, sugar source に Lactose を with い た Rogasa 's medium に planting bacteria し た. 37 degrees の good で cultivate を 気 conditions began to し, cultivated land の OD600 0.6 に が da し た と こ ろ で, cultivated land in the urea を に add す る. After adding and 経 に petty を small take し て, cultivated land in the urea concentration and び の ア ン モ ニ ア concentration determination を し, the lactic acid bacteria の ウ レ ア ー ゼ active を quantitative し た. そ の results, ウ レ ア ー ゼ の 発 が now confirmed さ れ た lactobacillus ク ロ ー ン の ウ レ ア ー ゼ active は raised plus し て い た. Renal insufficiency ラ ッ ト に し seaborne て ウ レ ア ー ゼ 発 now cast with lactobacillus を し て blood urea smothering element へ の unseen fruit を beg す 検 る た め, renal insufficiency ラ ッ ト を made し た.