低分子量G蛋白質Rhoによる標的蛋白質の認識機構の解明

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低分子量G蛋白質RhoAの標的蛋白質であるRhoキナーゼのRhoA結合ドメインRhoBD(69)については既に構造解析を終了している。この結果についての考察結果をまとめ、スイスで行われた国際結晶学会においてポスター発表を行った。構造解析を終了したRhoBD(69)についてRhoAとの結合実験を行ったところ、結合力が全長のRhoキナーゼと比較して弱いため、RhoAとの結合力の強いコンストラクトの設計及び作成を行い、それぞれのコンストラクトについて、大量発現系の確立、結合実験を行った。コンストラクトについては、Rhoキナーゼの全長のうち、コイルドコイル領域のC末側にあるRhoAとの結合に必要であると報告されている領域、及び既に我々が構造解析に成功している他のRhoAの標的蛋白質であるPKNのRhoA結合領域と配列上の相同性が高いコイルドコイル領域のN末側の領域についてそれぞれ複数個のコンストラクトの検討を行った。結合実験の結果、コイルドコイル領域のC末を含む領域はRhoAと結合することが確認できたが、コイルドコイル領域のC末を含む領域については、RhoAとの結合を確認することができなかった。そのため、現在はコイルドコイル領域のC末およびさらにC末に延びるPHドメインを含むコンストラクトについて結晶化及び結合実験などの実験を進めた。現在用いているRhoA結合領域はRhoキナーゼ自身のN末領域とも相互作用していることが報告されており、このN末領域との結合実験も行い結合を確認した。現在RhoキナーゼのRhoA結合領域とRhoAとの複合体及びRhoキナーゼのN末領域との複合体での結晶化のスクリーニングを行っている。