微小管ダイナミックスを制御する蛋白質複合体の構造学的研究

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CLIP-170の二つのCAP-Glyドメインによる微小管認識機構の解明及びCLIP-170の自己抑制機構の解明についての研究を行った。NMRを用いた構造解析に向けて、昨年度に引き続きサンプル調製およびスペクトルの測定を行った。特にCAP-Gly1,2とα,β-tubulinとの相互作用を検討する研究では、分子量が大きなものであるため、100%重水での培養及びサンプル調製を行った。さらに、大腸菌を用いた蛋白質発現及び精製が困難であると考えたサンプルについては、昆虫細胞Sf9を用いた培養を行った。今年度の研究については、NMRを用いた研究が主だったため、共同研究先の首都大学東京の有機構造生物化学研究室において行った。Sf9細胞の培養については、首都大学東京において、培養の立ち上げから行っており、昨年度までに、一度ウィルスの作成を終えたが目的たんぱく質の溶解度に問題があり、コンストラクトを再検討して、ウィルスの作成、および大量培養を行った。CLIP-170の二つのCAP-Glyドメインによる微小管認識機構の解明については、相互作用の相手がα,β-tubulinであることから、複合体の構造解析が難航しているが、本研究中に発見した、CLIP-170のCAP-Glyドメインとある種のリン脂質との複合体の構造解析については、複合体構造解析に有用なNMRのスペクトルが得られた。よって、他のたんぱく質のCAP-Glyドメインと、このリン脂質との相互作用を網羅的に検討するため、他の10種類のたんぱく質のCAP-Glyドメインのコンストラクトを作成、培養、精製を行い、NMRを用いた結合実験を行った。この他、微小管ダイナミックスの制御に関与するCLIP-170の周辺たんぱく質の構造解析に向けて、コンストラクトの作成、培養、精製、および、より良い性質のたんぱく質を得るため、NMRでのシグナル測定を用いて、溶液条件の検討および、リコンストラクトなどを行い、構造解析に向けての研究を行った。