化学物質の持つアンドロジェン様作用の評価法に関する研究

化学物质雄激素样作用评价方法研究

基本信息

批准号：
13027288
负责人：
冨永伸明
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Ariake National College of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

内分泌攪乱作用の中でもアンドロジェン様作用に注目し,線虫において外部からのアンドロジェン作用によって発現が応答する遺伝子をcDNAマイクロアレイを用いて一斉検索を行った.線虫C. elegansをアルカリブリーチ処理し,得られた受精卵を14時間絶食下で孵化させ,L1幼虫に同調した.その後,餌の大腸菌を与え40時間培養し,L2-3期の幼虫まで成長させ,1から1000nMのテストステロンに5時間暴露した.コントロール群および暴露群からmRNAを調製し,それぞれをOligo(dT)をプライマーに逆転写する際Cy3,Cy5でラベルした.得られた標識cDNAを等量混ぜ,線虫cDNAマイクロアレイにハイブリダイズし,各スポットにおける蛍光強度をスキャナーを用いて測定した.コントロールと暴露群の蛍光強度の比から各遺伝子の発現変動を解析した結果,種々濃度のテストステロンへの暴露によって約200個の遺伝子の発現量上昇と数個の遺伝子の発現量の減少が観察できた.それらデータを蓄積し,統計的に有為なデータを抽出し,クラスター解析を行った結果,それぞれの実験における発現量変動パターンから遺伝子をいくつかのグループとして分類することができた.さらに,再現性良くマイクロアレイで遺伝子の発現上昇が観察された遺伝子の変動幅の上位グループの中から,30個について特異的プライマーを構築し,RT-PCRで発現量の変化を半定量したところ,数個の遺伝子はRT-PCRレベルでテストステロン暴露によって遺伝子発現の増加が確認できた.以上の結果から,線虫C. elegansはステロイドホルモンに対して遺伝子レベルで特異的に応答していることが示され,内分泌攪乱作用の評価系におけるモデル生物として適当であり,cDNAマイクロアレイを用いることで応答遺伝子を網羅的に一斉検索できることが示された.

在内分泌破坏作用中，我们集中在类似雄激素的效果上，并使用cDNA微阵列对基因进行了同时搜索，这些基因对线虫中外部雄激素作用响应的基因响应。线虫C.秀丽隐杆线虫被碱性漂白，并在禁食下孵化所得的受精卵14小时，并与L1幼虫同步。之后，将大肠杆菌喂食并培养40小时，并生长至L2-3幼虫，并暴露于1至1000 nm的睾丸激素5小时。从对照组和暴露组中制备mRNA，当寡核酸（DT）反向转录成引物时，每个mRNA都用CY3和CY5标记。将相等量的标记cDNA混合，杂交与线虫cDNA微阵列，并使用扫描仪测量每个位置的荧光强度。从对照组和暴露组的荧光强度之比分析了每个基因的表达变异，并发现测试是不同的浓度。我们观察到大约200个基因的表达水平升高，并且由于暴露于八度的基因而导致的几个基因的表达水平降低。这些数据是积累的，提取了统计上有用的数据，并进行了群集分析，并且可以根据每个实验中表达水平的变化模式将基因归为几个组。此外，为30个具有基因变异的组构建了特异性引物，其中在微阵列中增加了基因表达，并具有很高的可重现性，并且当通过RT-PCR半定量表达水平的变化时，确认几个基因在RT-PCR水平上通过睾丸激素暴露在基因表达上增加了基因的增加。从上面的结果中，我们发现C.已显示秀丽隐杆线虫在基因水平上特别对类固醇激素做出反应，并且适合在评估系统中作为模型生物的内分泌干扰效应，并且cDNA微阵列可用于全面搜索响应基因。