上皮成長因子の情報伝達系の細胞内1分子可視化解析

表皮生长因子信号转导系统的细胞内单分子可视化分析

• 批准号: 13216067
• 负责人: 佐甲 靖志
• 金额: $ 2.94万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13216067/
• 关键词: 全反射蛍光顕微鏡; セミ・インタクト細胞; 自己リン酸化; SH2ドメイン; Grb2; Shc

上皮成長因子(EGF)による細胞増殖のための細胞内情報伝達系の働きを、細胞内で1分子計測し、解析することにより、増殖信号の伝達機構を解明することを目的として研究を行った。蛍光標識した情報分子や活性化型情報分子を認識する抗体を、対物レンズ型全反射蛍光顕微鏡を用いた細胞内蛍光1分子イメージング法で検出した。異なった蛍光色素で2種の分子を標識して同時観察することにより、分子の活性化や分子間相互作用を1分子計測した。(1)EGF受容体の自己リン酸化反応の1分子可視化: EGF受容体はEGFの結合によって活性化し自己リン酸化する。EGFを蛍光色素Cy3で、リン酸化した受容体を特異的に認識する抗体(mAb74)のFab'断片を蛍光色素Alexa488でそれぞれ標識した。SLOで細胞膜に穴を開けたA431細胞にCy3-EGFを結合させ、過剰なCy3-EGFを洗い流すとともに、Alexa-Fab'を加えて平衡化させ、ATPを加えてリン酸化反応を開始させた。Cy3とAlexaの輝点の局在を比較することにより、リン酸化部位を1分子検出できた。EGF受容体はEGFの結合以前からクラスターを作っているが、EGFの結合した受容体を含むクラスター内でEGFの結合していない受容体にもリン酸化が進行することが分かった。同時に、活性化受容体の部位数もEGF結合部位数より多くなることが分かった。(2)EGF受容体とSH2蛋白質の相互作用の1分子可視化:自己リン酸化したEGF受容体は多種のSH2蛋白質に認識される。Grb2全長およびShcのSH2ドメインををCy3で蛍光標識・精製し、正常なリン酸化EGF受容体認識能をもつことを確認した。リン酸化反応の検出と同様にSLOで処理した細胞で、蛍光色素Cy5で標識したEGF結合部位でCy3-SH2が結合・解離を繰り返す様子が観察された。Shcの解離速度は0.1/sのオーダーで、in vitroで生化学的に求められた報告値にほぼ一致したが、結合速度が10倍程度速いという結果を得た。細胞膜における受容体の高次構造形成や、蛋白質分子のヒステリシスによる多層的な反応性によるものと考えられる。

Epithelial growth factor (EGF), cell growth factor (EGF), cellular growth factor (EGF), cell The light marker, the emotion molecule, the active emotion molecule, the antibody, the object, the total reflection, the light micrometer, the intracellular light molecule, the intracellular light molecule, the active emotion molecule, the active emotion molecule, the antibody, the object, the total reflection, the light micrometer, the intracellular light molecule, the intracellular light molecule, the active emotion molecule, the antibody, the object, the total reflection, the light micrometer, the intracellular light molecule, the light molecule, the antibody, the object, the total reflection, the antibody, the object, the total reflection, the intracellular molecule, the molecule. At the same time, the light pigment 2 molecular marker is used to monitor the molecular interaction between the two molecules. The main results are as follows: (1) the EGF acceptor is acidified by its own acidification and the molecule can be acidified: the EGF acceptor is acidified by the combination of the EGF acceptor and the EGF receptor. EGF pigments Cy3, acidification, receptor specific antibodies (mAb74), Fab' fragments, Alexa488 fragments, Alexa488 tags. The cell membrane of SLO was activated by A431 Cy3-EGF, Cy3-EGF, Alexa-Fab', ATP and acidification. The Cy3 "Alexa" point is used to determine the molecular weight of the acidified site. The combination of the EGF receptor EGF and the previous one was used to make the test, and the combination of the EGF and the EGF was used to carry out the chemical acidification of the recipient. The number of simultaneous and active capacitive sites, the number of EGF combined with the number of sites, the number of multiple cycles, the number of segments. (2) EGF receptor SH2 protein

项目成果

Ueda, M., Sako, Y., Tanaka, T. et al.: "Single molecule analysis of chemotactic Signaling in Dictyostelium cells"Science. 294. 864-867 (2001)

Ueda, M.、Sako, Y.、Tanaka, T. 等人：“盘基网柄菌细胞中趋化信号的单分子分析”科学。