癌関連細胞周期調節遺伝子のソマティックノックアウト細胞の作成とその解析

癌症相关细胞周期调控基因的体细胞敲除细胞的创建和分析

基本信息

批准号：
13216101
负责人：
北川恭子
金额：
$ 2.43万
依托单位：
Hamamatsu University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13216101/
关键词：
癌ジーンターゲッティング p27^<Kip1>予後

项目摘要

細胞周期調節機構であるRB経路の構成因子の一つであるp27^<Kip1>は、予後不良の癌において分解が亢進しているのが確認されているが、その因果関係は未だ不明である。本研究ではRB経路の崩壊による細胞悪性化のメカニズムの解明を目標とする。本研究におけるヒト遺伝子の細胞レベルでの機能解析はノックアウトマウスや臨床検体を材料とするのでは困難であると考られたため、「ヒト細胞を用いたヒト遺伝子のコンディショナルソマティクノックアウト細胞」を作成して解析材料とすることにした。まずp27^<Kip>欠失細胞を得るためのターゲッティングベクターを構築した。ベクター中には相同組み換え体を効率よく選択するためにpositive/negative selectionが可能となる遺伝子を、またコンデショナルなノックアウトのために標的領域両端にloxP遺伝子を導入した。現在p27^<Kip1>の分解が亢進していない大腸癌細胞HT116にターゲッティングベクターを導入し、相同組み換え体をスクリーニングしている。またp27^<Kip1>存在量の低下モデルとして、p27^<Kip1>の分解実行因子であるSkp2の恒常発現HCT116細胞を樹立した。マイクロアレイによってSkp2高発現によって発現変動する遺伝子の同定を試みたところ、9種の候補遺伝子が同定された。今後はそれらの発現変動の有無をin vitroおよびin vivoレベルで再検証のうえ、臨床の癌検体における発現変動を調べるとともに、癌形質の変化への関与を分子レベルで検討する。また上記の組み換え体が得られ次第、これも対象にして同様に解析を進める。一連の研究成果からは新しい分子標的をターゲットとした癌の悪性度の診断法、予後不良の癌の治療法の開発、並びに癌の悪性化の予防薬の開発への発展が期待される。

p27^<kip1>是RB途径的组成因素之一，一种细胞周期调节机制，已被证实在预后较差的癌症中高度降解，但这种因果关系仍然未知。这项研究旨在阐明由于RB途径的破坏而导致细胞恶性肿瘤的机制。由于很难使用基因敲除小鼠或临床标本作为材料分析细胞水平上人类基因的功能分析，因此我们决定创建“使用人类细胞的条件体细胞基因敲除细胞”，并将其用作分析材料。首先，构建靶向载体以获得P27^<kip>缺失细胞。将允许正/阴性选择有效选择同源重组的基因引入了载体，并在目标区域的两端引入了LOXP基因以进行条件敲除。靶向载体已引入结肠癌细胞HT116，目前尚未发展到p27^<kip1>的进展，并筛选了同源重组剂。此外，作为降低p27^<kip1>丰度的模型，建立了HCT116细胞以表达SKP2的组成型，这是P27^<kip1>降解的因素。当试图鉴定由于微阵列高的SKP2表达而在表达中变化的基因时，鉴定了九个候选基因。将来，我们将重新检查这些表达的变化是否会在体外和体内进行，检查临床癌标本中表达的变化，并检查它们参与分子水平的癌症性状变化。同样，一旦获得了上述重组，这也将作为目标包括，分析以相同的方式进行。一系列的研究结果预计将导致开发针对新分子靶标的癌症恶性靶标的方法，以开发预后不良的癌症治疗方法，并开发预防药物以将癌症变成恶性肿瘤。