大脳皮質層構造形成機構におけるCNRカドヘリン分子群の機能解析

CNR-cadherin分子在大脑皮质层结构形成机制中的功能分析

• 批准号: 13780648
• 负责人: 先崎 浩次
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Okazaki National Research Institutes
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13780648/
• 关键词: 脳構造形成機構; カドヘリン; 系統進化; 大脳皮質形成機構

CNR分子群は大脳皮質形成機構に関わるReelin分子の多重受容体として機能していることが示唆されており、CNR分子群の分子機能解析により大脳皮質層構造形成機構の一端が明らかにされることが期待される。本研究では、特にCNR分子群の分子多様性の機能を明らかにすることを目的として、(1)CNR遺伝子多重欠損マウスの作製および解析、(2)各CNR特異抗体作製によるCNR分子多様性の機能解析、の2つのアプローチによる解析を行った。(1)CNR分子群のゲノム構造は、T細胞受容体や免疫グロブリンのゲノム構造に類似した遣伝子クラスター構造を形成している。このことからCNR遺伝子多重欠損マウスの作製法としては各CNRの多様性を形成している可変領域2カ所にloxP配列を導入し、Cre-loxP系を用いてCNR可変領域を欠失させることによりおこなった。まず、1カ所目にloxP配列を導入したES細胞よりホモマウスが作製されている。また、loxPの導入されているES細胞に2カ所目のloxP配列を導入し2カ所にloxP配列が導入されているES細胞よりキメーラマウスが3ライン作製されている。現在、ホモマウスの作製を行っており、今後、Creマウスとの掛け合わせにより、CNR遺伝子重欠損マウスを作製し、CNR分子多様性のマウス成体内における機能解析を行う。(2)各CNR蛋白質に対する特異抗体作製は、各CNRで多様性のあるEC2-3領域をGST融合蛋白質として作製し抗原に用いマウスモノクローナル抗体を作製した。また、各CNRで特異的なアミノ酸配列をKLH-ペプチド抗原として合成し抗原にもちい、ラットおよびウサギにおいてそれぞれモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を作製した。マウスモノクローナル抗体においては2種類の単一CNR特異認識抗体が得られている。また、ラットモノクローナル抗体においては5種類の単一CNR特異認識抗体が、ウサギポリクローナル抗体においては12種類の単一CNR特異認識抗体が得られた。これらの抗体を用いた成体マウス脳における免疫染色法での陽性細胞の局在様式は、各CNRに対する特異プローブを用いたin situハイブリダイゼーション法によるCNR mRNAの発現様式とほぼ同様であった。また、生後マウス脳における単一CNR特異抗体を用いた二重蛍光染色の結果、大脳皮質V層の神経細胞において異なる神経細胞にCNR蛋白質が発現していることが示された。今後、作製した各CNR特異抗体を用いて、マウス脳形成過程におけるCNR蛋白質の発現および局在様式の解析を行い、脳形成機構におけるCNR分子群の分子機能の解析を行う。

CNR molecular group is related to the formation mechanism of large cortex. The multiple receptors of Reelin molecules have different functions. The molecular function of CNR molecular group is analyzed. One end of the formation mechanism of large cortex structure is expected to be clarified. The purpose of this study is to clarify the function of molecular diversity of CNR molecular groups,(1) analyze the mechanism of multiple loss of CNR molecular groups,(2) analyze the function of molecular diversity of CNR specific antibodies, and (2) analyze the mechanism of multiple loss of CNR molecular groups. (1) The structure of CNR molecule group is similar to that of T cell receptor and immune system. The method for manufacturing multiple loss of CNR gene is to form multiple loss of CNR gene and to introduce loxP sequence into the multiple loss of CNR gene. 1. The loxP sequence is introduced into ES cells. 2. Introduction of loxP into ES cells 2. Introduction of loxP into ES cells 3. Now, Cre, Cre. (2)Production of specific antibodies to CNR proteins, production of GST fusion proteins to EC2-3 domains, production of specific antibodies to CNR proteins, production of GST fusion proteins to EC2- 3 domains In addition, the specific amino acid sequence of each CNR is produced by using KLH-peptide antigens and synthetic antigens, including KLH-peptide and KLH-peptide antibodies. There are two types of CNR-specific antibodies. 5 types of CNR-specific antibodies were obtained. The expression pattern of CNR mRNA was similar to that of CNR mRNA by immunostaining. CNR protein was detected in neurons of cortex V by double fluorescent staining with CNR specific antibody. In the future, the use of CNR-specific antibodies in the production, the analysis of CNR protein development and molecular function in the formation process, and the analysis of CNR molecular function in the formation mechanism will be carried out.

项目成果

Yagi T, Tada M, Tanaka Y, Senzaki K, et al.: "Diversity of the cadherin-related neuronal receptor family in the nervous system"International Congress Series. 1246. 127-136 (2002)

Yagi T、Tada M、Tanaka Y、Senzaki K 等人：“神经系统中钙粘蛋白相关神经元受体家族的多样性”国际大会系列。

Takei Y, Hamada S, Senzaki K, Mutoh T, Sugino H, Yagi T.: "Two novel CNRs from the CNR gene cluster have molecular features distinct from those of CNR1 to 8"Genomics. 72. 321-330 (2001)

Takei Y、Hamada S、Senzaki K、Mutoh T、Sugino H、Yagi T.：“来自 CNR 基因簇的两个新 CNR 具有与 CNR1 至 8 不同的分子特征”基因组学。