大脳皮質層構造形成機構におけるCNRカドヘリン分子群の機能解析

CNR-cadherin分子在大脑皮质层结构形成机制中的功能分析

• 批准号: 13780648
• 负责人: 先崎 浩次
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Okazaki National Research Institutes
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13780648/
• 关键词: 脳構造形成機構; カドヘリン; 系統進化; 大脳皮質形成機構

CNR分子群は大脳皮質形成機構に関わるReelin分子の多重受容体として機能していることが示唆されており、CNR分子群の分子機能解析により大脳皮質層構造形成機構の一端が明らかにされることが期待される。本研究では、特にCNR分子群の分子多様性の機能を明らかにすることを目的として、(1)CNR遺伝子多重欠損マウスの作製および解析、(2)各CNR特異抗体作製によるCNR分子多様性の機能解析、の2つのアプローチによる解析を行った。(1)CNR分子群のゲノム構造は、T細胞受容体や免疫グロブリンのゲノム構造に類似した遣伝子クラスター構造を形成している。このことからCNR遺伝子多重欠損マウスの作製法としては各CNRの多様性を形成している可変領域2カ所にloxP配列を導入し、Cre-loxP系を用いてCNR可変領域を欠失させることによりおこなった。まず、1カ所目にloxP配列を導入したES細胞よりホモマウスが作製されている。また、loxPの導入されているES細胞に2カ所目のloxP配列を導入し2カ所にloxP配列が導入されているES細胞よりキメーラマウスが3ライン作製されている。現在、ホモマウスの作製を行っており、今後、Creマウスとの掛け合わせにより、CNR遺伝子重欠損マウスを作製し、CNR分子多様性のマウス成体内における機能解析を行う。(2)各CNR蛋白質に対する特異抗体作製は、各CNRで多様性のあるEC2-3領域をGST融合蛋白質として作製し抗原に用いマウスモノクローナル抗体を作製した。また、各CNRで特異的なアミノ酸配列をKLH-ペプチド抗原として合成し抗原にもちい、ラットおよびウサギにおいてそれぞれモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を作製した。マウスモノクローナル抗体においては2種類の単一CNR特異認識抗体が得られている。また、ラットモノクローナル抗体においては5種類の単一CNR特異認識抗体が、ウサギポリクローナル抗体においては12種類の単一CNR特異認識抗体が得られた。これらの抗体を用いた成体マウス脳における免疫染色法での陽性細胞の局在様式は、各CNRに対する特異プローブを用いたin situハイブリダイゼーション法によるCNR mRNAの発現様式とほぼ同様であった。また、生後マウス脳における単一CNR特異抗体を用いた二重蛍光染色の結果、大脳皮質V層の神経細胞において異なる神経細胞にCNR蛋白質が発現していることが示された。今後、作製した各CNR特異抗体を用いて、マウス脳形成過程におけるCNR蛋白質の発現および局在様式の解析を行い、脳形成機構におけるCNR分子群の分子機能の解析を行う。

已经提出，CNR分子充当涉及大脑皮质形成机制的reelin分子的多个受体，并且可以预期，CNR分子的分子功能分析将揭示脑皮质结构形成机制的一端。特别是在这项研究中，我们使用两种方法分析了CNR分子组的分子多样性功能：（1）通过产生每种CNR特异性抗体的CNR分子多样性的多种缺乏的小鼠的创建和分析CNR分子多样性的功能分析。 （1）CNR分子组的基因组结构形成了类似于T细胞受体和免疫球蛋白的传感器簇结构。因此，作为创建具有多种CNR基因的小鼠的方法，将LOXP序列引入了两个变量区域，形成了每个CNR的多样性，并使用CRE-LOXP系统删除了CNR变量区域。首先，由在第一个位置引入LOXP序列的ES细胞产生HOMO小鼠。此外，已经从ES细胞中产生了三种芯片小鼠，其中已引入了LOXP，其中已引入了LOXP，并将LOXP引入了两个位置的ES细胞。当前，正在产生HOMO小鼠，将来，将通过将它们与CRE小鼠相结合而产生CNR基因的小鼠，并且将对成人的CNR分子多样性进行功能分析。 （2）对于针对每种CNR蛋白的特异性抗体的产生，作为GST融合蛋白制备了不同的EC2-3区域，并制备了小鼠单克隆抗体作为抗原。此外，将针对每个CNR特异的氨基酸序列合成为KLH肽抗原，分别在大鼠和兔子中制备了单克隆抗体和多克隆抗体。在小鼠单克隆抗体中获得了两种类型的单一CNR特异性识别抗体。此外，获得了大鼠单克隆抗体的五种类型的单一CNR特异性识别抗体，并获得了12种类型的单一CNR特异性识别抗体用于兔多克隆抗体。使用这些抗体在成年小鼠脑中免疫染色中阳性细胞的定位模式几乎与CNR mRNA的表达方式相同，并使用每种CNR的特定探针原位杂交。此外，使用单个CNR特异性抗体在产后小鼠大脑中使用双荧光染色表明，在大脑皮层层V层的神经元中，CNR蛋白在不同神经元中表达。将来，我们将使用所产生的每种CNR特异性抗体在小鼠脑形成过程中分析CNR蛋白的表达和定位模式，并分析CNR分子在脑形成机制中的分子功能。

项目成果

Yagi T, Tada M, Tanaka Y, Senzaki K, et al.: "Diversity of the cadherin-related neuronal receptor family in the nervous system"International Congress Series. 1246. 127-136 (2002)

Yagi T、Tada M、Tanaka Y、Senzaki K 等人：“神经系统中钙粘蛋白相关神经元受体家族的多样性”国际大会系列。