植物の塩および酸化ストレスに関与する膜輸送系の分子解析

参与植物盐和氧化应激的膜运输系统的分子分析

基本信息

批准号：
02F00677
负责人：
魚住信之
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

植物シロイヌナズナのK^+チャネルのKAT1とAKT2の両者はともに6回の膜貫通構造を有しており、その膜貫通構造を形成する領域のアミノ酸配列は似ている。KAT1はK^+を内向きに(取り込む方向)のみ透過する輸送体であるが、AKT2はK^+を内と外の両向きに透過する輸送体である。ところがKAT1は酵母の原形質膜のK^+輸送体の変異を相補し、AKT2は相補しない。このことからKAT1は原形質膜、AKT2は細胞内小器官の膜に発現していると考えられる。しかし、その細胞内局在性が分かっていない。本研究では、KAT1とAKT2の細胞内局在性を明らかにするために、酵母にGFP融合蛋白質を発現させて顕微鏡観察を行う。昨年度作成したKAT1とAKT2のキメラ蛋白質にGFPを融合した蛋白質を酵母で発現するために、酵母発現用ベクターに本遺伝子を挿入し、酵母に導入したところ、シグナルが細胞内の一部にシグナルの固まりが観察された。細胞膜からのシグナルも観察されたが、有意に局在性を示していないことから、明確な結果は得られなかった。同様にタバコ培養細胞においても明確な結果は得られなかった。一方、植物シロイヌナズナのK^+チャネルのKCO2についても同様の観察を行った。KCO2をAgrobacteriumによる形質転換により植物シロイヌナズナで発現させ顕微鏡観察したが結論は出なかった。現在、植物培養細胞を用いて一過的発現を検討している。

植物拟南芥K^+通道的Kat1和Akt2均具有六个跨膜结构，并且形成跨膜结构的区域的氨基酸序列相似。 KAT1是一种转运蛋白，仅在内外穿透K^+内（孵化），而AKT2是一种转运蛋白，可在内外穿透K^+。但是，KAT1补充了酵母质膜中的K^+转运蛋白突变，而AKT2则没有。这表明KAT1在质膜中表达，并且Akt2在细胞内细胞器的膜中表达。但是，其亚细胞定位尚不清楚。在这项研究中，为了阐明Kat1和Akt2的亚细胞定位，GFP融合蛋白在酵母中表达并进行显微镜观察。为了表达将GFP融合到去年在酵母中创建的Kat1和Akt2嵌合蛋白的蛋白质，将该基因插入酵母表达载体并引入酵母中，并将信号凝结到细胞的一部分中。还观察到来自细胞膜的信号，但由于没有明显的定位，因此未能获得明确的结果。同样，在烟草培养的细胞中未获得明确的结果。另一方面，在植物拟南芥的K^+通道中对KCO2进行了类似的观察。 KCO2在植物拟南芥中通过农杆菌转化，并在显微镜下观察到，但未得出结论。目前，正在使用植物培养细胞研究瞬态表达。