DNA組換え制御機構の構造生物学的解析

DNA重组控制机制的结构生物学分析

• 批准号: 13740432
• 负责人: 伊藤 隆
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13740432/
• 关键词: RecA; DinI; SOS応答; Mre11; DNA相同組換え; NMR; 高分子量蛋白質; ssDNA; dsDNA

RecAとDinIの相互作用の系については,transferred NOE法というNMRの手法を用いることで,RecA単体とRecA-DinI複合体の各々について単鎖DNAとの相互作用の解析を行った.その結果,RecAはDinIとの相互作用の有無にかかわらず,単鎖DNAと結合する活性を保持しており,RecAに結合している単鎖DNAのコンフォメーションもほぼ同一であることが判明した.DinIはRecAとLexAなどの蛋白質との相互作用を阻害してSOS反応を終結させると考えられているが,本研究の結果によって,DinIはRecAからDNAを遊離させて不活化させるのではなく,むしろRecAとLexA等との相互作用を競合的に阻害している可能性が強く示唆された.Mre11については,プロテアーゼ限定分解によるドメイン構造解析で同定されたC末端側約200残基の領域について,大腸菌内での大量発現系を構築し,精製条件を確立した.この領域はMre11ホモログの中で真核生物にのみ保存されており,減数分裂時のDNA相同組換えにおけるクロマチン構造変化に重要な領域である.単離されたこのドメインについて,NMRおよび蛍光分光法を用いて機能解析を行った.この結果,このC末端側ドメインはそれ自身で単鎖および二重鎖DNAと結合する活性を持っていることが示された.また,このドメインを大腸菌中で発現させ,in vivoでNMR測定を行う試みにも成功した.このアプローチを用いることでMre11のC末端領域と他の因子との相互作用をin vivoで,かつアミノ酸残基以上の分解能で観測できる可能性が示された.また,上記の機能解析と平行して高分子量蛋白質(および蛋白質複合体)のNMR解析のための方法論的研究も行い,効率的な蛋白質主鎖NMRシグナル帰属法を確立し発表した.

RecAとDinI <s:1> interaction に system に と て て transferred NOE method と い う NMR の gimmick を with い る こ と で, rec a 単 body と rec a - DinI complex の each 々 に つ い て 単 lock DNA と の interaction の parsing line を っ た. そ の results, rec a は DinI と の interaction の presence of に か か わ ら ず, 単 lock DNA と combining す る activity was を し て お り, rec a に combining し て い る 単 lock DNA の コ ン フ ォ メ ー シ ョ ン も ほ ぼ same で あ る こ と が.at し た. DinI は rec a と LexA な ど の protein と の interaction を resistance against し て SOS anti 応 を end さ せ る と exam え ら れ て い る が, this study results の に よ っ て, DinI は rec a か ら DNA を free さ せ て inactive さ せ る の で は な く, む し ろ rec a と LexA etc と の interaction を competition に resistance against し て い る strong possibility が く in stopping さ れ た. Mre11 に つ い て は, プ ロ テ ア ー ゼ finite decomposition に よ る ド メ イ ン structure で with fixed さ れ た C terminal side about 200 residues の field に つ い て, coliform in で の 発 a lot Now を build し, refining conditions を establish し た. こ の field は Mre11 ホ モ ロ グ の で in eukaryotes に の み save さ れ て お り, meiosis の DNA when the same group in え に お け る ク ロ マ チ ン structure - the に important area な で あ る. 単 from さ れ た こ の ド メ イ ン に つ い て, NMR お よ び 蛍 light spectrometry を with い analytic line を っ て function た. こ の results, こ の C terminal side ド メ イ ン は そ れ itself で 単 lock お よ び DNA double lock と combining す る active を hold っ て い る こ と が shown さ れ た. ま た, こ の ド メ イ ン を coliform in で 発 now さ せ, in Vivo で NMR measurement line を う try み に も successful し た. こ の ア プ ロ ー チ を with い る こ と で Mre11 の と he の factor C terminal field と の を interaction in Vivo で, か つ ア ミ ノ acid residues above の can decompose で 観 measuring で き が る possibility in さ れ た. ま た, written の function analytical と parallel し て high molecular weight protein (お よ び protein complex) の NMR analytical の た め の methodology research も い, sharper rate な protein main lock NMR シ グ ナ ル を 帰 genera method established し 発 table し た.

项目成果

Takehiko Shibata: "Homologous genetic recombination as an intrinsic dynamic property of a DNA strncture induced by RecA/Rad5 1-family proteins : possible advantage of DNA over RNA as genomic material"Proceedings of the National Academy of Sciences of the

Takehiko Shibata：“同源基因重组作为 RecA/Rad5 1-family 蛋白诱导的 DNA 结构的内在动态特性：DNA 作为基因组材料相对于 RNA 的可能优势”美国国家科学院院刊

Masatoshi Yoshimasu: "NMR approaches to investigate protein-protein and protein-nucleic acid complexes"RIKEN Review. 46. 32-35 (2002)

Masatoshi Yoshimasu：“研究蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸复合物的核磁共振方法”RIKEN Review。