虚血性内耳障害における遺伝子治療の基礎的研究

缺血性内耳疾病基因治疗的基础研究

• 批准号: 14770903
• 负责人: 白馬 伸洋
• 金额: $ 3.01万
• 依托单位: Ehime University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14770903/
• 关键词: 虚血性内耳障害; 遺伝子治療; アデノウイルスベクター; G-DNF; ウエスタンブロット法; X-gal染色; スナネズミ; 蝸電図

本研究では一過性内耳虚血の動物モデルを用いて、正円窓経由で注入を行ったアデノウイルスの蝸牛内での発現の確認と、ウイルスベクターを介した神経栄養因子の一つであるG-DNFの投与を行い、内耳虚血後に内有毛細胞にて認められる遅発性細胞死に対する防御効果の検討を行った。1)スナネズミ蝸牛におけるアデノウイルス発現確認。スナネズミを麻酔後、正円窓経由に蝸牛内に蛍光発色蛋白質の発現を促す遺伝子を組み込んだLacZアデノウイルスベクターの注入を行った。注入4日後、蝸牛を摘出、パラホルムアルデヒドにて固定後、X-gal染色を行い、立体顕微鏡下にてウイルスの発現の観察を行った結果、蝸牛全体にウイルスの発現が認められた。またG-DNFを組み込んだアデノウイルスベクターを同様の方法にて蝸牛内に注入し、注入後の蝸牛内におけるG-DNF蛋白の測定をウエスタンプロット法にて測定を行った結果、注入7日目にてコントロールと比較し、約40倍のG-DNF蛋白の発現が認められた。2)一過性内耳虚血障害に対するG-DNFウイルスベクターによる防御効果の生理学的検討。スナネズミ蛸牛にG-DNFを組み込んだアデノウイルスベクターおよびコントロール群として外リンパ液を正円窓経由に注入し、注入4日後にスナネズミ両側椎骨動脈の血流速断・再開通により一過性内耳虚血の負荷を行った。虚血前後における動物の聴力の評価は蝿電図を測定することによって行った。結果、虚血7日目にてG-DNFアデノウイルス群がコントロール群と比較し、聴力域借上昇が有意に抑制されていた。3)一過性内耳虚血障害に対するG-DNFウイルスベクターによる防御効果の組織学的検討。虚血による内耳障害の組織学的検討についてはRhodaraine-phalloidinおよびHechst33342で採取した蝸牛の二重染色を行い、有毛細胞のF-actinと核を蛍光顕微鏡で観察し、有毛細胞の障害程度について観察をした。結果、虚血7日目にてG-DNFアデノウイルス群がコントロール群と比較し、内有毛細胞の脱落割合が有意に抑制されていた。以上の結果より、蝸牛内に投与されたアデノウイルスは蝸牛内に広く感染し、G-DNF蛋白の著明な発現を誘導すること、またアデノウイルスによって誘導されたG-DNF蛋白により、一過性虚血後の内有毛細胞における遅発性細胞死が抑制され、聴力障害が軽減されることが明らかとなり、内耳虚血障害に対する、G-DNFアデノウイルスベクターによる遺伝子治療の有効性が証明された。

In this study, the animals with transient inner ear blood deficiency were injected into the human body using the injection method.行ったアデノウイルスの Inside the snail での発appearのconfirmationと、ウイルスベクターを Introductionした神経栄NUTRITIONING FACTOR の一つであるG-DNF のinvestment を行い、After the inner ear is empty of blood There are hairy cells and the cells are dead and the defense effect is fine. 1) The snail snail is now confirmed. After intoxicating the スナネズミをhemp, the positive and negative effects are caused by the light-colored protein inside the snail.す伝子を组み込んだLacZアデノウイルスベクターの成を行った. 4 days after the injection, the snails were removed, the snails were fixed, and X-gal staining was performed and the three-dimensional The result of the inspection under the microscope is the result of the inspection, and the entire snail is identified.またG-DNFを组み込んだアデノウイルスベクターを同様の method Determination of G-DNF protein in the snail after injection and in the snail after injection The results of the をウエスタンプロット method and the を行った test were injected into the 7th day of the にてコンCompared with トロールと, it is about 40 times that of G-DNF protein. 2) A study on the physiology of the defensive effect of transient inner ear blood deficiency disease G-DNF.スナネズミ蛸牛にG-DNFを组み込んだアデノウイルスベクターおよびコントロール群として外リンパ Liquid を正円The blood flow rate of the lateral vertebral artery was cut off and re-opened 4 days after the injection, and the load was reduced due to transient inner ear blood deficiency. Before and after blood deficiency, the animal's vitality is evaluated and measured. As a result, the blood deficiency of the 7-day eye G-DNF アデノウイルス群がコントロール群とComparisonし, the power domain increased and the intentional suppression was done. 3) Histological study of the protective effect of transient inner ear blood deficiency G-DNF sterilization. Hechst 33342 Hechst33342 The double-stained lines of the snail were taken, the F-actin nuclei of the hairy cells were examined under a microscopic microscope, and the degree of damage of the hairy cells was examined. As a result, the blood deficiency of the 7-day eye G-DNF アデノウイルス群がコントロールgroup was compared, and the hair cells inside were shed and cut, and the hair cells were intentionally suppressed. The results of the above are the results of the infection in the snail, the infection of the snail, and the G-DNF protein. Ming な発appears to induce すること, またアデノウイルスによって induces されたG-DNF protein により, transient deficiency There are hair cells in the back of the blood, and the cell death is inhibited, and the blood is damaged, and the hair cells are reduced. The effectiveness of G-DNF in the treatment of ear deficiency and blood disorders has not been proven.

项目成果

Hakuba N, Watabe K, Hyodo J et al.: "Adenovirus-mediated overexpression of a gene prevents hearing loss and progressive inner hair cell loss after transient cochlear ischemia in gerbils"Gene Therapy. 10(5). 426-433 (2003)

Hakuba N、Watabe K、Hyodo J 等人：“腺病毒介导的基因过度表达可预防沙鼠短暂性耳蜗缺血后的听力损失和进行性内毛细胞损失”基因疗法。

Koga K, Hakuba N, Watanabe F et al.: "Transient cochlear ischemia causes delayed cell death in the organ of Corti : an experimental study in gerbils."J Comp Neurol. 456(2). 105-111 (2003)

Koga K、Hakuba N、Watanabe F 等人：“短暂的耳蜗缺血导致 Corti 器官延迟细胞死亡：一项针对沙鼠的实验研究。”J Comp Neurol。

Taniguchi M, Hakuba N, Koga K et al.: "Apoptotic hair cell death after transient cochlear ischemia"Neuroreport. 20;13. 2459-2462 (2003)

Taniguchi M、Hakuba N、Koga K 等人：“短暂性耳蜗缺血后毛细胞凋亡”Neurreport。

Hakuba N, Watabe K, Hyodo 7 et al.: "Adenovirus-mediated overexpression of a gene prevents hearing loss and progressive inner hair cell loss after transient cochlear ischemia in gerbils."Gene Therapy. 10(5). 426-433 (2003)

Hakuba N、Watabe K、Hyodo 7 等人：“腺病毒介导的基因过度表达可预防沙鼠短暂性耳蜗缺血后的听力损失和进行性内毛细胞损失。”基因治疗。

白馬伸洋, 兵頭純, 谷口昌史ら: "虚血性内耳障害に対する遺伝子治療"Otol Jpn.. 12(3). 155-159 (2003)

Nobuhiro Hakuba、Jun Hyodo、Masashi Taniguchi 等：“缺血性内耳疾病的基因治疗”Otol Jpn.. 12(3) (2003)。