Klonierung und funktionelle Charakterisierung von PASKIN, einem neuen, potentiellen Sauerstoffsensor in Säugetierzellen

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Hintergrund: Alle Säugetierzellen besitzen die Fähigkeit, eine Reduktion des verfügbaren Sauerstoffes (Hypoxie) zu messen und sich sehr rasch durch die Aktivierung entsprechender Gene an die veränderten Umweltbedingungen anzupassen. Trotz der eminenten Bedeutung dieses Vorganges (bei z.B. Ischämie, Wundheilung, Embryogenese oder der Tumorprogression) ist der eigentliche zelluläre Sauerstoffsensor immer noch unbekannt. Vorarbeiten: Kürzlich konnten wir ein neues Säugetiergen klonieren, das einem bakteriellen Sauerstoffsensor ähnelt. Das Genprojekt erhielt den Namen PASKIN, da es eine PAS und eine Kinase Domäne enthält, die für die bakterielle Sauerstoffmessung und Signalweitergabe von essentieller Bedeutung sind. Ziel: Die umfassende Charakterisierung der Expression und Funktionen von PASKIN. Arbeitsprogramm: 1. Vollständige Sequenzanalyse der klonierten PASKIN Gene aus Mensch und Maus; 2. Herstellung von rekombinantem PASKIN Protein bzw. Fragmenten davon in Bakterienkulturen; 3. Herstellung von Antikörpern gegen PASKIN; 4. Analyse des subzellulären und in situ Expressionsmusters von PASKIN; 5. Spektroskopische Untersuchung und Analyse der Kinaseaktivität von rekombinantem PASKIN; 6. Funktionelle Analysen von PASKIN-defizienten embryonalen Stammzellen und Mäusen; 7. Klonierung von mit PASKIN interagierenden Proteinen im "Yeast two-Hybrid" System.