転写伸長を制御する因子の立体構造及びRNAポリメラーゼとの相互作用の解析

转录延伸控制因子的三维结构分析及其与RNA聚合酶的相互作用

• 批准号: 14780528
• 负责人: 杤尾 豪人
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Yokohama City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14780528/
• 关键词: RNAポリメラーゼ; 転写伸張; クロマチン; 転写; 転写伸長反応

HDAg(Hepatitis Delta Antigen)は全長195アミノ酸残基であるが、分析超遠心法によると見かけの分子量が六量体(140kDa)相当となっている。HDAgの会合はN末端のロイシンジッパーモチーフによって引き起こされると考えられること、HDAgのRNAポリメラーゼ結合能はC末端側の約70残基のみで再現されることが示されていることから、ロイシンジッパーを除いたHDAgのRNAポリメラーゼ結合領域(66残基、以下HDAg-Δ129と呼ぶ)のみのコンストラクトを研究に使用している。HDAg-Δ129のN末端GST融合蛋白質として発現させようとしているが、大腸菌破砕後、融合蛋白質の大部分は封入体となって不溶画分となり、可溶画分に得られたものは全体の一割程度である。そこで、HDAg-Δ129の可溶化・巻き戻しを試みた。グアニジン塩酸塩や尿素で不要画分を可溶化、洗浄後、様々なバッファー条件に急速希釈した。しかしながら、未だ良好な可溶化条件が見つかっておらず、NMR測定に供するには十分な量の試料を調製できていない。大腸菌を低温で培養することにより、封入体への経路を押さえることができるが、HDAg-Δ129では大きな効果は得られなかった。そこで、現在は使用するベクターや、コンストラクトを変えて、高収率に蛋白質が発現・精製できる条件を探索している。

HDAg(Hepatitis Delta Antigen) has a total length of 195 amino acid residues and a molecular weight of 140kDa. HDAg RNA fragment binding energy is about 70 residues on the C-terminal side. The binding energy of HDAg RNA fragment binding domain (66 residues, HDAg-Δ129) is used in research. The N-terminal GST fusion protein of HDAg-Δ129 has been discovered for some time. After E. coli disruption, most of the fusion protein remains insoluble in the enclosed body, and soluble components remain intact. The solubility of HDAg-Δ129 was investigated. For example, if you want to dissolve, wash, or remix, you can quickly change the conditions. For NMR measurements, ten percent of the sample is prepared under poor solubility conditions. Coliform bacteria are cultured at low temperature, and the passage of the enclosed body is closed. HDAg-Δ129 is large. The conditions for protein production and purification with high yield are explored.

项目成果

Auesukaree C, Homma T, Tochio H, Shirakawa M, Kaneko Y, Harashima S.: "Intracellular phosphate serves as a signal for the regulation of the PHO pathway in Saccharomyces cerevisiae."Journal of Biological Chemistry. 279,17. 17289-17294 (2004)

Auesukaree C、Homma T、Tochio H、Shirakawa M、Kaneko Y、Harashima S.：“细胞内磷酸盐在酿酒酵母中充当调节 PHO 途径的信号。”生物化学杂志。

Fujiwara K, Tenno T, Sugasawa K, Jee JG, Ohki I, Kojima C, Tochio H, Hiroaki H, Hanaoka F, Shirakawa M.: "Structure of the ubiquitin-interacting motif of S5a bound to the ubiquitin-like domain of HR23B."Journal of Biological Chemistry. 279,6. 4760-4767 (2

Fujiwara K、Tenno T、Sugasawa K、Jee JG、Ohki I、Kojima C、Tochio H、Hiroaki H、Hanaoka F、Shirakawa M.：“与 HR23B 泛素样结构域结合的 S5a 泛素相互作用基序的结构