TLRシグナル伝達を決定するTIRドメイン間の相互作用の立体構造学的研究

决定 TLR 信号转导的 TIR 域之间相互作用的三维结构研究

• 批准号: 16770079
• 负责人: 杤尾 豪人
• 金额: $ 2.37万
• 依托单位: Yokohama City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16770079/
• 关键词: 自然免疫; NMR; 構造生物学; Toll like receptor; MyD88; Toll様受容体

本研究では、自然免疫系のアダプター分子MyD88の細胞機能の解明を目指し、MyD88に含まれるTIRドメインの立体構造及び機能の解析を行なった。1)立体構造解析溶液NMRで立体構造決定を行なうために、^<13>C,^<15>Nで標識したMyD88 TIRドメインを調製し、各種多核多次元核磁気共鳴(NMR)の測定を行ない、これらの測定データを基に^1H,^<13>C,^<15>N核の化学シフトの帰属作業、各種三次元NOESYの解析を行ない、二次構造要素の同定と^1H間の距離情報の取得を行なった。次に、これらのデータから、立体構造計算を行なった。得られたMyD88 TIRの立体構造は、既に構造が解かれているTLR1やTLR2のTIRドメインと類似しているが、ループ部分の長さや、一部のα-ヘリックスの配向などに差異があることがわかった。2)機能解析MyD88 TIRドメインの自然免疫シグナル伝達系における機能解析を行なうべく、HEK293培養細胞系でルシフェラーゼを使ったレポーターアッセイの系を立ち上げた。コントロールのHEK293細胞では、IL-18で刺激することにより自然免疫系のシグナル伝達経路を通してNF-κBが活性化されることを確認した。その一方で、野生型のMyD88 TIRドメインを過剰発現させた場合は、そのDominant Negative効果により、IL-18刺激後のNF-κBの活性が有意に下がることも確認した。現在、立体構造情報に基づいて、種々のアミノ酸置換を導入したMyD88 TIRドメイン変異体をこの細胞に発現させて、IL-18刺激後にNF-κBの活性を測定し、どの残基がシグナル伝達に重要なのかを調べている。この他にRAW264.7細胞を使ってリポ多糖による刺激を行なうアッセイ系も確立した。

This study で は, natural immune system の ア ダ プ タ ー molecular MyD88 の cell function の interpret を refers し, MyD88 に containing ま れ る TIR ド メ イ ン の three-dimensional structure and function of び の parsing line を な っ た. 1) three-dimensional structure analytic solution NMR で three-dimensional structure decision を line な う た め に, ^ < 13 > C, ^ < 15 > N で logo し た MyD88 TIR ド メ イ ン を し modulation, all kinds of multi-core multidimensional nuclear magnetic 気 resonance (NMR) determination of の を line な い, こ れ ら の determination デ ー タ を base に ^ 1 h, ^ < 13 > C ^ < 15 > N nuclear の chemical シ フ ト の 帰 belongs to the work, all kinds of three dimensional NOESY の parsing line を な の い, secondary structure elements with fixed と の distance between h ^ 1 intelligence を の Line なった. The following lines: に, なった れら デ デ タ ら ら ら, three-dimensional structure calculation を line なった. Have ら れ た MyD88 TIR の three-dimensional structure は, both に が solution か れ て い る TLR1 や TLR2 の TIR ド メ イ ン と similar し て い る が, ル ー プ の partially さ や, a の alpha ヘ リ ッ ク ス の match to な ど に differences が あ る こ と が わ か っ た. 2) functional analytic MyD88 TIR ド メ イ ン の natural immune シ グ ナ ル 伝 da system に お け る line function analytical を な う べ く, HEK293 culture cell lines で ル シ フ ェ ラ ー ゼ を make っ た レ ポ ー タ ー ア ッ セ イ の を made ち fasten げ た. コ ン ト ロ ー ル の HEK293 cells で は, IL - 18 で stimulation す る こ と に よ り natural immune system の シ グ ナ ル 伝 da 経 を tong road し て nf-kappa B が activeness さ れ る こ と を confirm し た. そ の で, wild type の MyD88 TIR ド メ イ ン を through turning 発 now さ せ た は, そ の Dominant Negative working fruit に よ り, IL - 18 stimulation の nf-kappa B の under active が intentionally に が る こ と も confirm し た. Now, three-dimensional structure intelligence に づ い て, kind of 々 の ア ミ ノ acid replacement を import し た MyD88 TIR ド メ イ ン - variant を こ の cells に 発 now さ せ て, IL - 18 stimulation に nf-kappa B の active を determination し, ど の residues が シ グ ナ ル 伝 に important な の か を adjustable べ て い る. The に にRAW264.7 cell を causes the ってリポ polysaccharide による to stimulate the を line なうアッセ line to establish the た.

项目成果

Molecular mechanism of a temperature-sensitive phenotype in peroxisomal biogenesis disorder

• DOI: 10.1203/01.pdr.0000169984.89199.69
• 发表时间: 2005-08-01
• 期刊: PEDIATRIC RESEARCH
• 影响因子: 3.6
• 作者: Hashimoto, K;Kato, Z;Kondo, N
• 通讯作者: Kondo, N

Structural characterization of the MIT domain from human Vps4b

• DOI: 10.1016/j.bbrc.2005.06.110
• 发表时间: 2005-08-26
• 期刊: BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS
• 影响因子: 3.1
• 作者: Takasu, H;Jee, JG;Hiroaki, H
• 通讯作者: Hiroaki, H

High-throughput construction method of expression vector of peptides for NMR study suited for isotopic labeling.

适用于同位素标记的核磁共振研究肽表达载体的高通量构建方法。

• 发表时间: 2004
• 期刊: Protein Eng Des Sel 17
• 作者: Tenno;T.;Goda;N.;Tateishi;Y.;Tochio;H.;Mishima;M.;Hayashi;H.;Shirakawa;M.;Hiroaki;H.
• 通讯作者: H.

Crystal structure of thymine DNA glycosylase conjugated to SUMO-1

• DOI: 10.1038/nature03634
• 发表时间: 2005-06-16
• 期刊: NATURE
• 影响因子: 64.8
• 作者: Baba, D;Maita, N;Shirakawa, M
• 通讯作者: Shirakawa, M

Structure of the ubiquitin-interacting motif of S5a bound to the ubiquitin-like domain of HR23B

• DOI: 10.1074/jbc.m309448200
• 发表时间: 2004-02-06
• 期刊: JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
• 影响因子: 4.8
• 作者: Fujiwara, K;Tenno, T;Shirakawa, M
• 通讯作者: Shirakawa, M