RNA干渉法を用いたトランスポーターノックダウンマウスの作出と薬物動態解析

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様々な組織において薬物トランスポーター群は異物解毒に関わっているが、これらの基質選択性に関する詳細な検討は、基質によって同じサブファミリーに属するトランスポーターのすべてがそれを認識する場合や一部のものが認識する場合など複雑であり、それらの寄与率の算出は非常に難しい。本課題では、RNA干渉法を用いてそれぞれのトランスポーターの発現が抑制されたノックダウンマウスを作出し、薬物動態研究に貢献したいと考えている。このモデルとしてERMタンパクを標的とした検討を現在行っている。近年、Radixinノックアウトマウスでは胆汁うっ滞が起こることが示され、この原因として肝臓の胆管側膜に発現するMRP2が内在化していた。このapical膜への局在にERM蛋白のひとつであるRadixinの関与が示唆されたことからERM蛋白が他のトランスポーターにおいても細胞膜への局在に関与することが考えられる。この発現を抑制すればERMタンパクに依存して膜に発現するトランスポーターの発現が一挙に抑制されたマウスの作出が可能である。しかし、RNA干渉の効果を持つ配列をまず同定しなくてはならない。そこでMDR1やMRP2など研究の進んでいるトランスポーターが発現しているCaco-2細胞を用いて、その細胞に発現するEzrin、Radixinそれぞれを抑制するsiRNAの探索を行った。過去の論文を参考に、標的部位をRadixinについては6箇所、Ezrinに対しては4箇所予測し、それに対するsiRNAをIn vitroで合成した。このsiRNAをCaco-2細胞に導入し、siRNAによる発現抑制効果をRT-PCRで検討したところ、Radixinの発現を抑制するsiRNAが一種類同定できた。現在このsiRNAに関してはさらにタンパクレベルでの抑制効果を検討している。またEzrinに対する合成した四種類のsiRNAはその効果が見られなかったため、他の標的部位の探索とsiRNAの導入量を増やすなどの検討を行っている。