セントロメアGATA因子Ams2及びSMCタンパク質Cut3の結合因子Cti1の機能解析

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Project 1Ams2はセントロメアに結合する新規なGATA因子で、セントロメア特異的なヒストンH3バリアントCENP-Aの温度感受性株(cnp1-1)の多コピーサープレッサーとして単離された(Chen et al.,2003)。ams2破壊株ではCENP-AのDNA結合能は著しく低下した。ヒストンH4の大量発現もcnp1-1の温度感受性とams2破壊株の生育欠損を相補した。この相補現象を説明するために、Ams2とヒストンH4の転写の関わりを調べた。野生株のバックで、誘導可能なプロモータでAms2を発現し、Northern hybridization法を行ったところヒストンH4の転写量が上昇することを観察した。これを確認するためは更にDNA microarrayの解析が必要と考えられる。それにより他の特にセントロメア領域における未知な転写現象も明らかになるかもしれない。Project 2コンデンシンは二つのSMCタンパク質、及び三つの非SMCタンパク質から形成され、染色体凝縮に必須な複合体である。最近、コンデンシンは細胞周期間期におけるDNA損傷の修復にも必要であることがAono et al.(2002)によって報告された。我々はコンデンシンのSMCサブユニットCut3のhinge領域と相互作用するCti1という因子をtwo hybrid法を用いて単離した。In vitroのGST-pulldown法とin vivoの免疫沈降法を用いてCti1はCut3と物的に相互作用していることを証明した。そこで、Cti1とコンデンシンの間期DNA損傷修復機能との関わりを調べた。その結果、Cti1の大量発現はコンデンシン非SMCサブユニットCnd2変異株cnd2-1の温度感受性を部分的に相補することを見出した。Cti1の発現はcnd2-1だけではなく、コンデンシンの他のサーブユニット(cut3及びcut14)の変異株の温度感受性もallele-specific的に相補した。驚いたことに、Cti1の大量発現はcnd2-1のDNA複製阻害剤hydroxyurea(HU)と紫外線に対する超感受性も相補することを発見した。従って、Cti1はコンデンシンの間期機能と関係があることが分かった。GFP融合したCti1タンパク質を用いて細胞内局在を調べたところ、細胞周期を通じて核小体に蓄積し、クロマチン領域にも薄く存在していることを見出した。面白いことに、HUの存在下ではCti1はクロマチンにより多く局在した。Detergentで細胞内のクロマチンに結合していないタンパク質を取り除いたところ、Cti1はHU処理に依存してクロマチン結合能が上がることを発見した。まとめの仮説としては、DNA損傷が生じると、Cti1は損傷部位に局在し、コンデンシンをrecruitし、そのDNA損傷修復の機能を助けるのではないかと考えている。