軟骨由来多機能成長因子CTGFの遺伝子発現、及び血管新生作用機序の解明

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結合組織成長因子CTGF/CCN2がある種の癌細胞に高発現していることに着目し、その遺伝子発現制御機構と血管新生作用を結び付けた癌細胞の低酸素暴露実験を行ってきた。そしてHCS-2/8において低酸素状態がctgf/ccn2 mRNAを誘導し、その機序はmRNAの安定性の増大が重要な役割を果たしている事が明らかになった。以前ctgf/ccn2のsteady-state mRNA levelを変える責任領域が3'-UTRの上流84bpに存在し、この部分のRNA probeを作製し、低酸素下で調整した核内及び細胞質タンパク質との結合をRNAゲルシフトアッセイ及びUVクロスリンクアッセイで検討したところ、低酸素暴露した場合の結合力が増大していることを確認していた。本年度はこの84bpの断片とレポータ遺伝子のキメラ遺伝子を作製し、これを元に試験管内RNA合成を行い、通常酸素もしくは低酸素暴露した細胞から抽出した細胞質タンパク質と反応させると低酸素暴露した細胞質タンパク質と反応させたRNAの分解速度が遅くなっていることを確認した(RNA分解試験)。またこの結合タンパクを詳細に調べる為、UVクロスリンクアッセイ、ノースウェスタンを行うと84bpの領域内と核内および細胞質で低酸素下で結合力の増す、35kDaのタンパクの存在が明らかになった。現在この実験事実をもとに、この結合タンパクの同定を目指している。手法として84bpのRNA断片によるRNAアフィニティークロマトグラフィーを作製し、大量の細胞核分画を材料として特異的因子を精製した後、タンパク試料を質量分析(PMF解析)し、タンパクを同定する予定である。