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軟骨由来多機能成長因子CTGFの遺伝子発現、及び血管新生作用機序の解明

软骨源性多功能生长因子CTGF基因表达及血管生成机制的阐明

基本信息

批准号：
03J02538
负责人：
近藤誠二
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

結合組織成長因子CTGF/CCN2がある種の癌細胞に高発現していることに着目し、その遺伝子発現制御機構と血管新生作用を結び付けた癌細胞の低酸素暴露実験を行ってきた。そしてHCS-2/8において低酸素状態がctgf/ccn2 mRNAを誘導し、その機序はmRNAの安定性の増大が重要な役割を果たしている事が明らかになった。以前ctgf/ccn2のsteady-state mRNA levelを変える責任領域が3'-UTRの上流84bpに存在し、この部分のRNA probeを作製し、低酸素下で調整した核内及び細胞質タンパク質との結合をRNAゲルシフトアッセイ及びUVクロスリンクアッセイで検討したところ、低酸素暴露した場合の結合力が増大していることを確認していた。本年度はこの84bpの断片とレポータ遺伝子のキメラ遺伝子を作製し、これを元に試験管内RNA合成を行い、通常酸素もしくは低酸素暴露した細胞から抽出した細胞質タンパク質と反応させると低酸素暴露した細胞質タンパク質と反応させたRNAの分解速度が遅くなっていることを確認した(RNA分解試験)。またこの結合タンパクを詳細に調べる為、UVクロスリンクアッセイ、ノースウェスタンを行うと84bpの領域内と核内および細胞質で低酸素下で結合力の増す、35kDaのタンパクの存在が明らかになった。現在この実験事実をもとに、この結合タンパクの同定を目指している。手法として84bpのRNA断片によるRNAアフィニティークロマトグラフィーを作製し、大量の細胞核分画を材料として特異的因子を精製した後、タンパク試料を質量分析(PMF解析)し、タンパクを同定する予定である。

Tissue growth factor CTGF/CCN2 is associated with high levels of tumor cell development, angiogenesis, and low levels of tumor cell exposure. HCS-2/8 mRNA is induced by low levels of ctgf/ccn2 mRNA, and the stability of mRNA is increased. It was confirmed that the RNA probe in the upstream 84bp of the 3'-UTR was regulated under low acidity and the binding force increased under the condition of intracellular and cytoplasmic protein binding. This year, the 84bp DNA fragment was detected by RNA digestion assay, and the rate of RNA degradation was determined by RNA digestion assay. The binding capacity of the protein was increased in the 84bp domain, in the nucleus and in the cytoplasm under low acidity, and the presence of the 35kDa protein was clearly detected. Now, we're going to do this, and we're going to do this together. Methods: 84bp RNA fragments were prepared, a large number of nuclear analysis materials were purified, and samples were analyzed for quality (PMF analysis).