二本鎖RNAを用いたSmad結合タンパク1(Sip1)の核内シグナル伝達の解明

使用双链 RNA 阐明 Smad 结合蛋白 1 (Sip1) 的核信号转导

• 批准号: 15790067
• 负责人: 山田 憲一郎
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Institute for Developmental Research, Aichi Human Service Center
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15790067/
• 关键词: ZFHX1B; Sip1; siRNA; ヒルシュスプルング病症候群; 知的障害

我々は、ヒルシュスプルング病症候群がZFHX1B(Smad interacting protein-1 (Sip1)をコードする)の異常で発症することを初めて明らかにした。本研究は、本症の病態を分子レベルで明らかにするために、siRNAを用いて培養細胞及びマウスの初代脳培養細胞内のSip1の機能を阻害し、その結果生じる様々な遺伝子の発現異常や、神経細胞の形態変化等を明らかにすることを目的としている。ZFHX1BをノックダウンするsiRNAの作製を行った。(1)4種類のSip1に特異的な配列のsiRNAをin vitroで合成した。これらのsiRNAを293細胞に導入し、Sip1の発現量をRT-PCR法により定量した。1種類のsiRNAが、Sip1の発現量を何も加えないコントロールに比べ約30%抑制していた。(2)ヒトSip1の開始コドンから約600bp領域の2本鎖RNAを作製し、Dicer酵素により約25merの断片にしたsiRNAを293細胞に導入した。Sip1発現量はコントロールに比べ、約60%抑制された。(3)9種類のsiRNA配列をpSUPERに挿入し、siRNAを細胞内で発現するベクターを作製した。また、Luciferaseの3'-非翻訳領域に、上記のsiRNAの標的となるSip1の配列を挿入したsiCHECKベクターも作製した。293細胞に上記のsiRNA発現ベクターとsiCHECKベクターを同時に導入後、Luciferase活性を測定し、siRNAの発現抑制効果を評価した。1種類のベクターが、コントロールに比べ約80%抑制していた。(3)で作製したsiRNAベクターは、sip1の機能を十分に阻害できることが明らかとなった。現在、マウスのP19細胞にsiRNA発現ベクターを導入し、神経細胞の形態変化の異常等を解析している。

I 々 は, ヒ ル シ ュ ス プ ル ン グ disease syndrome が ZFHX1B (Smad interacting protein 1 (Sip1) を コ ー ド す る) abnormal の で す 発 disease る こ と を early め て Ming ら か に し た. の は this study, the disease pathological を molecular レ ベ ル で Ming ら か に す る た め に, siRNA を with い て cultured cells and び マ ウ ス の original 脳 culture cells の Sip1 の function を resistance against し, そ の result born じ る others 々 な heritage 伝 son の 発 の is abnormal や, god 経 cell morphology variations such as を Ming ら か に す る こ と を purpose と し て い る. ZFHX1Bをノッ ダウ する する するsiRNA is prepared in を rows った. (1) Four types of <s:1> Sip1に specific な are paired with <s:1> siRNAをin vitroで to synthesize <s:1> た. <s:1> れら <s:1> siRNAを293 cells に were introduced into を, and the occurrence amount of Sip1 <s:1> was を quantified by RT-PCR によ を た. 1 species の siRNA が, Sip1 の 発 now what quantity を も え な い コ ン ト ロ ー ル に than about 30% inhibition べ し て い た. (2) ヒ ト Sip1 の began コ ド ン か ら の 2 about 600 bp field this lock RNA を し, Dicer enzyme に よ り about 25 killing の fragment に し た siRNA を 293 cells に import し た. The occurrence of Sip1 is approximately 60% inhibited by された compared to べ. (3) 9 kinds の siRNA match column を pSUPER に scions into し, siRNA を intracellular で 発 now す る ベ ク タ ー を cropping し た. ま た, Luciferase の 3 '- not turn に 訳 field, written の siRNA の mark と な る Sip1 の match column を scions into し た siCHECK ベ ク タ ー も cropping し た. 293 cells に written の siRNA 発 now ベ ク タ ー と siCHECK ベ ク タ ー を simultaneously に after import, determination of Luciferase activity を し, siRNA の 発 inhibit sharper now fruit を review 価 し た. 1 species の ベ ク タ ー が, コ ン ト ロ ー ル に than about 80% inhibition べ し て い た. (3) で cropping し た siRNA ベ ク タ ー は, sip1 の function を very に resistance against で き る こ と が Ming ら か と な っ た. Now, マ ウ ス の P19 cell に siRNA 発 now ベ ク タ ー を import し, god の 経 cells form - の を analytical techniques, such as abnormal し て い る.

项目成果

Disruption in the hypoxanthine phosphoribosyltransferase gene caused by translocation in a patient with Lesch-Nyhan syndrome

Lesch-Nyhan 综合征患者易位导致次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因破坏

• 发表时间: 2004
• 期刊: Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 23
• 作者: Mizunuma M;Yamada Y;Yamada K;Santa S;Wakamatsu N;Kaneko K;Ogasawara N;Fujimori S
• 通讯作者: Fujimori S

Mutations in the hypoxanthine guanine phosphoribosyltrans-ferase gene (HPRT1) in Asian HPRT deficient families.

亚洲 HPRT 缺陷家族中次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因 (HPRT1) 的突变。

• 发表时间: 2004
• 期刊: Nucleosides Nucleotides and Nucleic Acids 23・8&9
• 作者: Yamada Y;et al.
• 通讯作者: et al.

Mizunuma M, Yamada Y, Yamada K, Wakamatsu N, et al.: "Disruption in the hypoxanthine phosphoribosyltransferase gene caused by translocation in a patient with Lesch-Nyhan syndrome."Nucleosides Nucleotides and Nucleic Acid. (in press). (2004)

Mizunuma M、Yamada Y、Yamada K、Wakamatsu N 等人：“Lesch-Nyhan 综合征患者易位导致次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因破坏。” 核苷 核苷酸和核酸。

Clinical and molecular analysis of Mowat-Wilson syndrome associated with ZFHX1B mutations and deletions at 2q22-q24.1

• DOI: 10.1136/jmg.2003.016154
• 发表时间: 2004-05-01
• 期刊: JOURNAL OF MEDICAL GENETICS
• 影响因子: 4
• 作者: Ishihara, N;Yamada, K;Wakamatsu, N
• 通讯作者: Wakamatsu, N

Yamada Y, Yamada K, Sonta S, Wakamatsu N, Ogasawara N.: "Mutations in the hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase gene (HPRT1) in Asian HPRT deficient families."Nucleosides Nucleotides and Nucleic Acid. (in press). (2004)

Yamada Y、Yamada K、Sonta S、Wakamatsu N、Ogasawara N.：“亚洲 HPRT 缺陷家族中次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因 (HPRT1) 的突变。”核苷 核苷酸和核酸。