神経細胞の軸索誘導における分子メカニズムの同定

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本研究では、繊維芽細胞の遊走・走化性に必要なシグナル分子がマウスの小脳顆粒細胞の遊走や軸索ガイダンスにも共通して重要であるかを解明することを目標とする。現在までに、それらの細胞系の初代培養手法を樹立した。単層培養グリア細胞上での小脳顆粒細胞の培養とともに、2次元ないし3次元における小脳顆粒細胞の分散培養や凝集培養での細胞動態が検討された。特に小脳顆粒細胞の凝集からの培養では、3次元のコラーゲンゲル内の培養でも2次元の培養でも印象的な神経突起伸長が観察された。引き続き解析には、蛍光顕微鏡での観察に適した後者の2次元培養を選択した。マウス胎児繊維芽細胞(MEF)については、心臓・肺・腎臓・体壁組織のうち、肺・体壁から単離したものが血小板由来成長因子(PDGF-BB)の濃度勾配に対して走化性を示したため、体壁由来のMEFを選択した。このように確立した初代培養系の走化性を観察するために、改良Dunn走化性チャンバーと多視野自動顕微鏡を用いたハイスループット観察系を樹立した。更に、RT-PCRによって、Cdc42サブファミリー(Cdc42,Tc10,Tcl,Chp)、Racサブファミリー(Rac1,2,3 and RhoG)のGTPアーゼがMEFに発現することを確認し、それらのcDNAを単離した。これらの分子の細胞遊走における役割や機能補完を解析する目的で、RNA干渉法を最適化した。現在のところ、Cdc42ノックダウンされたMEFが、細胞体の収縮とともに長く伸びた形態を示し、部分的な遊走の異常を示すことが観察された。しかしながら、走化性は保たれることから今まで重要と考えられてきたCdc42のシグナルとは別のシグナル機構が繊維芽細胞の走化性を制御することが示唆された。更に、今後Cdc42サブファミリーの2種の細胞系の遊走における役割を比較できるように、小脳顆粒細胞におけるRNA干渉法の最適化も行った。