神経細胞の軸索誘導における分子メカニズムの同定

神经元轴突引导分子机制的鉴定

基本信息

批准号：
04F04712
负责人：
成宮周
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、繊維芽細胞の遊走・走化性に必要なシグナル分子がマウスの小脳顆粒細胞の遊走や軸索ガイダンスにも共通して重要であるかを解明することを目標とする。現在までに、それらの細胞系の初代培養手法を樹立した。単層培養グリア細胞上での小脳顆粒細胞の培養とともに、2次元ないし3次元における小脳顆粒細胞の分散培養や凝集培養での細胞動態が検討された。特に小脳顆粒細胞の凝集からの培養では、3次元のコラーゲンゲル内の培養でも2次元の培養でも印象的な神経突起伸長が観察された。引き続き解析には、蛍光顕微鏡での観察に適した後者の2次元培養を選択した。マウス胎児繊維芽細胞(MEF)については、心臓・肺・腎臓・体壁組織のうち、肺・体壁から単離したものが血小板由来成長因子(PDGF-BB)の濃度勾配に対して走化性を示したため、体壁由来のMEFを選択した。このように確立した初代培養系の走化性を観察するために、改良Dunn走化性チャンバーと多視野自動顕微鏡を用いたハイスループット観察系を樹立した。更に、RT-PCRによって、Cdc42サブファミリー(Cdc42,Tc10,Tcl,Chp)、Racサブファミリー(Rac1,2,3 and RhoG)のGTPアーゼがMEFに発現することを確認し、それらのcDNAを単離した。これらの分子の細胞遊走における役割や機能補完を解析する目的で、RNA干渉法を最適化した。現在のところ、Cdc42ノックダウンされたMEFが、細胞体の収縮とともに長く伸びた形態を示し、部分的な遊走の異常を示すことが観察された。しかしながら、走化性は保たれることから今まで重要と考えられてきたCdc42のシグナルとは別のシグナル機構が繊維芽細胞の走化性を制御することが示唆された。更に、今後Cdc42サブファミリーの2種の細胞系の遊走における役割を比較できるように、小脳顆粒細胞におけるRNA干渉法の最適化も行った。

这项研究旨在阐明成纤维细胞迁移和趋化性所需的信号分子是否在小鼠小脑颗粒细胞的迁移和轴突引导中也很常见。迄今为止，已经建立了这些细胞系的主要培养方法。除了在单层培养的神经胶质细胞上培养小脑颗粒细胞外，还研究了小脑颗粒细胞在两个或三个维度中分散和聚集的培养物中的细胞动力学。特别是，在小脑颗粒细胞聚集的培养物中，在三维培养物和二维培养物中都观察到了惊人的神经突生长。为了进行分析，选择了适合在荧光显微镜下观察的后二维培养物。至于小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），选择了体壁衍生的MEF，因为那些从心脏的肺和体壁，肺，肾脏和身体壁隔离的人对血小板衍生生长因子（PDGF-BB）的浓度梯度表现出趋化性。为了观察这样建立的原发性培养系统的趋化性，使用改进的DUNN趋化室和多场自动显微镜建立了高通量观察系统。此外，RT-PCR证实了Cdc42亚家族（CDC42，TC10，TCL，CHP）和RAC亚家族（Rac1、2、3和RHOG）的GTPase在MEF中表达，并且它们的CDNA被隔离。优化了RNA干扰法以分析这些分子在细胞迁移中的作用和功能完成。目前，已经观察到，CDC42击倒MEF表现出持久的形态，并具有细胞体收缩，并且在部分迁移中表现出异常。然而，保持趋化性的维持，表明一种信号机制与CDC42的信号不同，Cdc42的信号迄今已被认为是重要的，它调节成纤维细胞趋化性。此外，我们还优化了小脑颗粒细胞中的RNA干涉法，因此可以比较两个细胞系在Cdc42亚家族中的作用。