シナプス構成蛋白質の質量分析法による翻訳後修飾及び機能解析

质谱法对突触组成蛋白的翻译后修饰和功能分析

• 批准号: 15700289
• 负责人: 山内 英美子
• 金额: $ 1.98万
• 依托单位: The University of Tokushima
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15700289/
• 关键词: 質量分析; シナプス; 成長円錐; リン酸化

本研究の目的は、近年、蛋白質の構造解析に最も重要かつ効果的な手段の一つとなったナノ高速液体クロマトグラフと組み合わせた質量分析法を用い、神経機能において情報伝達やネットワーク形成、神経伝達の可塑性に重要な役割を果たす神経シナプス結合部のシグナル伝達の未知の分子機構を解明するため、申請者が既に同定した集積蛋白質の分子間相互作用、翻訳後修飾解析による機能解析、またプレシナプス終末構成タンパク質の同定と、シナプスを介するシグナル伝達に関わる新規因子の探索を目的としたものである。本年度は、質量分析を用いて同定された前シナプス、シナプスを形成する前段階である成長円錐の新規な複数の機能未知タンパク質について昨年度に引き続きさらにいくつかの蛋白質について特異的な抗体作成を行った。作成した特異抗体を用いて、蛍光免疫染色により神経様培養細胞を用いて突起伸張過程における細胞内局在の解析を行った。作成した一部については特異的な突起先端部の発現が見られ、新規な成長円錐たんぱく質であることが示唆された。また、ラット脳の細胞分画を用いて、成長円錐への局在を確認したところ、成長円錐に加え、他の細胞内画分にも局在することが分かった。また、質量分析による解析により、脂質修飾など、翻訳後を受けている蛋白質も含まれることを確認した。また、大腸菌に発現させた新規成長円錐蛋白質を用いて、結合蛋白質を神経様培養細胞及び質量分析を用いて検索を行い、複数の結合蛋白質を見出した。現在、哺乳類細胞発現用タグ付タンパク質発現ベクターの構築、作製を行い、哺乳類細胞内での結合を確認している。

The purpose of this study is to investigate the most important methods for protein structure analysis in recent years, including the use of high-speed liquid chromatography and mass spectrometry, the function of the brain, the formation of protein, the plasticity of the brain, the important effects of protein binding, and the unknown molecular mechanism. The applicant has identified the molecular interactions of aggregated proteins, post-translational modification analysis, functional analysis, and final composition of protein. This year, the quality analysis was used to determine the previous status of the protein, the formation of the previous stage, the growth of the cone, the new function of the unknown protein, the quality of the previous year, the preparation of specific antibodies. The preparation of specific antibodies, light immunostaining, and analysis of intracellular processes in cultured cells The appearance of the tip of the protrusion is seen in the new regulation. In addition, the cell division of the growth cone is confirmed. In addition, the cell division of the growth cone is confirmed. In addition, the cell division is confirmed. Quality analysis, analysis, lipid modification, protein content confirmation New regulations for the development of E. coli, growth cone proteins, binding proteins, cell culture and mass analysis, and the discovery of multiple binding proteins At present, mammalian cell development uses the construction and operation of the protein development system, and mammalian cell integration is confirmed.

项目成果

Myosin-Va regulates exocytosis through the submicromolar Ca2+-dependent binding of syntaxin-1A.

• DOI: 10.1091/mbc.e05-03-0252
• 发表时间: 2005-10
• 期刊: Molecular biology of the cell
• 影响因子: 3.3
• 作者: Michitoshi Watanabe;Kazushige Nomura;A. Ohyama;R. Ishikawa;Y. Komiya;K. Hosaka;E. Yamauchi;H. Taniguchi;N. Sasakawa;K. Kumakura;T. Ushiki;O. Sato;M. Ikebe;M. Igarashi