シナプス構成蛋白質の質量分析法による翻訳後修飾及び機能解析

本研究の目的は、近年、蛋白質の構造解析に最も重要かつ効果的な手段の一つとなったナノ高速液体クロマトグラフと組み合わせた質量分析法を用い、神経機能において情報伝達やネットワーク形成、神経伝達の可塑性に重要な役割を果たす神経シナプス結合部のシグナル伝達の未知の分子機構を解明するため、申請者が既に同定した集積蛋白質の分子間相互作用、翻訳後修飾解析による機能解析、またプレシナプス終末構成タンパク質の同定と、シナプスを介するシグナル伝達に関わる新規因子の探索を目的としたものである。本年度は、質量分析を用いて同定された前シナプス、シナプスを形成する前段階である成長円錐の新規な複数の機能未知タンパク質について昨年度に引き続きさらにいくつかの蛋白質について特異的な抗体作成を行った。作成した特異抗体を用いて、蛍光免疫染色により神経様培養細胞を用いて突起伸張過程における細胞内局在の解析を行った。作成した一部については特異的な突起先端部の発現が見られ、新規な成長円錐たんぱく質であることが示唆された。また、ラット脳の細胞分画を用いて、成長円錐への局在を確認したところ、成長円錐に加え、他の細胞内画分にも局在することが分かった。また、質量分析による解析により、脂質修飾など、翻訳後を受けている蛋白質も含まれることを確認した。また、大腸菌に発現させた新規成長円錐蛋白質を用いて、結合蛋白質を神経様培養細胞及び質量分析を用いて検索を行い、複数の結合蛋白質を見出した。現在、哺乳類細胞発現用タグ付タンパク質発現ベクターの構築、作製を行い、哺乳類細胞内での結合を確認している。

本研究の目的は、近年、蛋白質の構造解析に最も重要かつ効果的な手段の一つとなったナノ高速液体クロマトグラフと組み合わせた質量分析法を用い、神経機能において情報伝達やネットワーク形成、神経伝達の可塑性に重要な役割を果たす神経シナプス結合部のシグナル伝達の未知の分子機構を解明するため、申請者が既に同定した集積蛋白質の分子間相互作用、翻訳後修飾解析による機能解析、またプレシナプス終末構成タンパク質の同定と、シナプスを介するシグナル伝達に関わる新規因子の探索を目的としたものである。本年度は、質量分析を用いて同定された前シナプス、シナプスを形成する前段階である成長円錐の新規な複数の機能未知タンパク質について昨年度に引き続きさらにいくつかの蛋白質について特異的な抗体作成を行った。作成した特異抗体を用いて、蛍光免疫染色により神経様培養細胞を用いて突起伸張過程における細胞内局在の解析を行った。作成した一部については特異的な突起先端部の発現が見られ、新規な成長円錐たんぱく質であることが示唆された。また、ラット脳の細胞分画を用いて、成長円錐への局在を確認したところ、成長円錐に加え、他の細胞内画分にも局在することが分かった。また、質量分析による解析により、脂質修飾など、翻訳後を受けている蛋白質も含まれることを確認した。また、大腸菌に発現させた新規成長円錐蛋白質を用いて、結合蛋白質を神経様培養細胞及び質量分析を用いて検索を行い、複数の結合蛋白質を見出した。現在、哺乳類細胞発現用タグ付タンパク質発現ベクターの構築、作製を行い、哺乳類細胞内での結合を確認している。