イントロンを利用した新規遺伝子発現系による他生物種由来酵素高生産株の分子育種

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前年度の研究で得られたグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(gpd)遺伝子のプロモーターを改変しリグニンペルオキシダーゼcDNA配列(LiPcDNA)に連結して作成した改良型プロモーター-リグニンペルオキシダーゼcDNA配列(LiPcDNA)-Le.priAターミネーターから成る発現系を持つ発現プラスミド及びgpdプロモーター-LiPcDNA-改良型ターミネーターから成る発現系を持つ発現プラスミドによる形質転換株と、コントロールとして通常のgpdプロモーター-LiPcDNA発現系を持つプラスミドによるアラゲカワラタケ形質転換株の選択を行った。寒天培地上での成長速度や、得られた株から抽出した全DNAを鋳型としたPCR法による多型解析などを行い、転写発現解析・酵素活性測定に適当であると判断した株を各5株ずつ選択し、分子育種株の特性検証を行った。得られた形質転換株を液体培地にて培養し、培養濾液中に放出されるリグニン分解酵素の活性を比較したところ、改良型プロモーター、改良型ターミネーターによる発現系を持つ一部の形質転換株は、通常のプロモーターによる発現系を持つコントロール株に対し20〜30%程度高い酵素活性を示すことがわかった。これらの分子育種株の全RNAに対し、培養時間を追って転写産物の経時的な解析を行ったところ、Lip遺伝子の転写産物量変化は酵素活性の変化とほぼ同じ挙動を示すことがわかった。しかしながら続けて詳細な定量的解析を行ったところ、時間・変化量共に完全に一致するものではなく、転写から酵素活性を示すまでの過程において何らかの因子が関わっており、酵素の生産量あるいは培養液中に放出される酵素量が制御されていると考えられる結果が得られた。