胚性幹細胞におけるHEXによる肝細胞への分化誘導と機能解析

今回ES細胞において安定したHexの発現を行うために,Doxにより遺伝子発現を誘導しえるES細胞(Ainv18)(Kyba M. et al. Cell 109 29-37,2002)を用いる。このtet0の下流にHex cDNAを導入することで、Doxの添加でHexを過剰発現するES細胞(tet-Hex ES細胞)を作成した(Kubo Blood 105,4590-4597,2005).無血清培養条件下でアクチビンを2-6日まで添加することで内胚葉を誘導後に、Doxを添加してHexの過剰発現を誘導する。内胚葉誘導時期である6-10日にHexを過剰発現させるとアルブミン遣伝子が発現することが分かった。一方、持続的に22日まで発現させると、アルブミンの発現が低下することから一過的なHexの発現が重要と考えられた、また、成熟肝細胞のマーカーであるCpase, TAT, Cyp7alなどの発現も確認した。また、免疫染色施行してアルブミン陽性細胞を認めた。さらに我々は、これらの細胞上清を用いて、アルブミン、トランスフェリンを測定し、Hexを発現させた群でのみアルブミンやトランスフェリンの分泌を認めた。さらに、Hexを過剰発現した細胞とHexの過剰発現のない細胞の比較、ならびにHex+/+の細胞を14日間肝細胞条件で培養した群とHex-/-の細胞を14日間肝細胞条件で培養した群とをマイクロアレイで比較して、Hexの下流遺伝子を検索した。これらの解析により、albumin, transferrinなどの血清蛋白、apolipoproteinなどのような脂質、fibrinogenなどの凝固関連因子などがHexにより制御されていることが明らかにされた。

今回ES細胞において安定したHexの発現を行うために,Doxにより遺伝子発現を誘導しえるES細胞(Ainv18)(Kyba M. et al. Cell 109 29-37,2002)を用いる。このtet0の下流にHex cDNAを導入することで、Doxの添加でHexを過剰発現するES細胞(tet-Hex ES細胞)を作成した(Kubo Blood 105,4590-4597,2005).無血清培養条件下でアクチビンを2-6日まで添加することで内胚葉を誘導後に、Doxを添加してHexの過剰発現を誘導する。内胚葉誘導時期である6-10日にHexを過剰発現させるとアルブミン遣伝子が発現することが分かった。一方、持続的に22日まで発現させると、アルブミンの発現が低下することから一過的なHexの発現が重要と考えられた、また、成熟肝細胞のマーカーであるCpase, TAT, Cyp7alなどの発現も確認した。また、免疫染色施行してアルブミン陽性細胞を認めた。さらに我々は、これらの細胞上清を用いて、アルブミン、トランスフェリンを測定し、Hexを発現させた群でのみアルブミンやトランスフェリンの分泌を認めた。さらに、Hexを過剰発現した細胞とHexの過剰発現のない細胞の比較、ならびにHex+/+の細胞を14日間肝細胞条件で培養した群とHex-/-の細胞を14日間肝細胞条件で培養した群とをマイクロアレイで比較して、Hexの下流遺伝子を検索した。これらの解析により、albumin, transferrinなどの血清蛋白、apolipoproteinなどのような脂質、fibrinogenなどの凝固関連因子などがHexにより制御されていることが明らかにされた。