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外部刺激に応答する細胞内シグナル伝達経路解明を指向した蛍光性キナーゼ基質の開発

开发荧光激酶底物，旨在阐明响应外部刺激的细胞内信号转导途径

基本信息

批准号：
18760590
负责人：
富崎欣也
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

タンパク質の多様化要因の一つ、リン酸化を触媒するキナーゼは種類も多く、細胞内シグナル伝達に関与する重要な酵素であるにもかかわらず、反応溶液中に過剰に存在するATPトリリン酸基による妨害のため、酵素活性を迅速・簡便に評価するキナーゼ基質の設計は比較的困難であった。そこで、本研究では、キナーゼが触媒するリン酸化反応を迅速・簡便に評価できる蛍光性キナーゼ基質の設計合成と細胞応答評価を目的とした。平成18年度は蛍光シグナル発生用プローブの選択とキナーゼ活性評価法開発を行った。様々な蛍光色素を検討した結果、フォトクロミック化合物であるスピロピランと基質ペプチドとのコンジュゲート利用がキナーゼ基質設計を最も容易にすることがわかった。これは、基質ペプチドがリン酸化(アニオン付加)を受けると、アニオン性ポリマーとの結合が静電反発で弱められるため強い蛍光、一方、カチオン性ポリマーとの親和性が静電的相互作用により向上するため弱い蛍光を示す原理に基づく。従って、それら蛍光強度の比をとることで、リン酸化状態のシグナル強度は非リン酸化状態のシグナル強度と比べ顕著に大きくなることが予想できる。そこで、代表的な4種キナーゼに対応するスピロピラン含有基質ペプチドを設計合成し、スピロピランのフォトクロミズム、ポリアスパラギン酸およびポリリシンを利用するリン酸化反応検出を試みた。4種の酵素濃度の上昇に伴い、シグナル強度が増大、飽和に達し、リン酸化状態における最大シグナル強度は非リン酸化状態と比較し約2倍であった。また、96穴プレート上にて目視によるキナーゼ阻害活性を評価したところ、阻害剤濃度依存的に着色量が変化し、本キナーゼ活性検出法は蛍光および目視両方によるシグナル検出が可能であった。平成19年度は、本結果を受けて細胞中のキナーゼ活性評価へと適用範囲を拡大する予定である。

The main factors of quality diversification include the variety of enzymes, the presence of ATP in the reaction solution, the inhibition of enzyme activity, the rapid and simple evaluation of enzyme activity, and the difficulty of substrate design. This study aims to provide a rapid and simple evaluation of the design and synthesis of photocatalysts. In 2018, the development of the activity evaluation method was carried out for the selection and development of new products. As a result of the study of the pigment, it is easy to use the pigment matrix to design the pigment matrix. The principle of electrostatic interaction is based on the principle of strong light, one side, strong affinity, and weak light. The ratio of the intensity of the light to the intensity of the acid state is greater than that of the light intensity. The four types of media represented by this article include matrix design, synthesis, and utilization. The concentrations of the four enzymes increased with the increase of their concentrations, reaching saturation, and increasing with the increase of their concentrations. 96 points on the visual barrier activity evaluation, the barrier agent concentration dependent coloring amount change, the original barrier activity detection method is the visual barrier activity detection The results of this study were used to evaluate the activity of the cells in Heisei 19.