Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen, welche auf die Kernhülle bildende Vesikel lokalisiert sind

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In höheren Eukaryonten ist die Kernhülle bestehend aus äußerer und innerer Kernmembran während des Zellzyklus eine hochdynamische Struktur. Sie wird beim Eintritt der Zelle in die Mitose dissoziiert und in der Telophase um die Tochterchromosomen wieder assoziiert. Die molekularen Mechanismen, die zur Ausbildung der Kernmembranen führen, sind zum gegenwärtigen Zeitpunkt weitgehend unklar. Dieser Prozess kann in einem zellfreien Testsystem aus Eiern von Xenopus laevis untersucht werden. In diesem Testsystem konnte gezeigt werden, dass zur Ausbildung der Kernmembran zwei Populationen von Vesikeln und die kleine GTPase Ran benötigt werden. Das hier vorgeschlagene Forschungsvorhaben beinhaltet die biochemische Charakterisierung der Membran dieser Vesikel. Es sollen zum einen auf diesen Vesikeln Effektorproteine von Ran identifiziert werden. Hierzu soll ein Detergenzextrakt der Vesikel an eine Ran-GTP und Ran-GDP-Affinitätssäule gebunden werden. Ran bindende Proteine sollen durch massenspektrometrische Analyse identifiziert werden. In einem weiteren allgemeineren Ansatz sollen integrale Membranproteine der Vesikel durch eine Triton-X-114-Phasentrennung angereichert und eventuell nach Analyse durch zweidimensionale Gelelektrophorese durch Massenspektroskopie identifiziert werden. Durch die beiden Ansätze neu identifizierte Proteine sollen kloniert und biochemisch charakterisiert werden. Ihre Bedeutung für die Ausbildung der Kernhülle soll im zellfreien Testsystem durch Depletion oder Inhibierung untersucht werden.