Characterization of hepatitis E virus (HEV) particles and analysis of replication mechanism by using a cell culture system for HEV

使用 HEV 细胞培养系统表征戊型肝炎病毒 (HEV) 颗粒并分析复制机制

• 批准号: 19390134
• 负责人: OKAMOTO Hiroaki
• 金额: $ 11.81万
• 依托单位: Jichi Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-19390134/
• 关键词: 分子; E型肝炎ウイルス; 細胞培養; 感染性cDNAクローン; モノクローナル抗体; 蛍光抗体法; ORF3欠損変異ウイルス; ORF3抗原; 放出機構; 中和抗体; ORF2抗原; 劇症肝炎

本研究は、研究代表者らが世界で初めて確立することができたE 型肝炎ウイルス(HEV)の感染培養系を用いた研究である。1) E 型肝炎患者の糞便浮遊液中に含まれるHEV 野生株(JE03-1760F_wt、遺伝子型3)をPLC/PRF/5 細胞に接種し、培養液中に放出された子孫ウイルスを新たな細胞に感染させる継代培養を13 回繰り返すことによって、野生株より10 倍以上感染効率の高い馴化HEV(JE03-1760F_p13)を得ることができた。また、E 型劇症肝炎患者から得られた糞便浮遊液を接種することにより、新たに4 型HEV(HE-JF5/15F)株の培養系を確立することができた。JE03-1760F 株と同様に、培養液中に産生された子孫HE-JF5/15F ウイルスは感染性を有し、6代目の継代培養において、接種後2 日目に培養上清中での子孫ウイルスの出現が確認され、10日目には1.5 x 10^8 copies/ml のウイルス量に達した。HE-JF5/15F_p6 ウイルスに認められたORF1 領域とORF2 領域での10 塩基(4 アミノ酸残基)の変異が活発な増殖能に関連があると考えられた。2) カイコ蛹で発現した組換えHEV キャプシド(ORF2)抗原蛋白質を免疫原として、9 種類のマウスモノクローナル抗体を作製した。そのうちの1 つ(H6225)は、HEV 粒子との結合能を有し、強い感染阻止能(中和活性)を有することが感染培養実験によって明らかになった。また、HEVORF3 蛋白質のC 末端に相当する24-mer 合成ペプチドを用い10 種類のマウスモノクローナル抗体を作製した。これら抗ORF2, ORF3 モノクローナル抗体を用いた蛍光抗体法により、ORF2 抗原は細胞質、とくに小胞体とゴルジ体、ORF3 抗原は細胞質および細胞質膜に局在することがわかった。3) 培養上清中に放出されたHEV 粒子はショ糖液中での浮上密度が1.15 g/ml と軽く、糞便中のHEV 粒子(1.26-1.27 g/ml)と異なること、そしてその表面に細胞膜成分とともにORF3 蛋白を有すること、加えてそれら細胞膜成分とORF3 蛋白は界面活性剤と蛋白分解酵素による処理によって除かれ、糞便中HEV 粒子と同様の浮上密度に変化しうることを明らかにした。4) A549 細胞とPLC/PRF/5 細胞において、糞便由来野生株(JE03-1760F)と同等の感染性と増殖能を有する感染性cDNA クローン(pJE03-1760F/wt)を構築することができた。加えて、ORF3のATG コドンをGCA に置換した変異ウイルス(pJE03-1760F/ΔORF3)を作製し、培養細胞に接種したところ、感染性を有していることが分かった。しかし、ORF3 欠損変異ウイルスは細胞内でのHEV RNA レベルが野生株と同等でありながら、培養上清中ではHEV RNA は検出されないか、極めて低いレベルであり、分泌能を欠いていることが明らかになった。本研究により、これまで機能が不明であったORF3 蛋白はHEV 粒子の放出に必須であり、放出された粒子上に細胞膜成分とともに構造蛋白の一つとして存在していることが初めて明らかになった。これらの研究成果は、HEV 感染の制御ならびに増殖機構や放出機構のさらなる解明に役立つものと考えられる。

This study was conducted on behalf of the world's first established hepatitis E infection culture system. 1)HEV wild strain (JE03 -1760F_wt, genotype 3) was found in fecal suspension of hepatitis E patients. The infection rate of HEV wild strain (JE03 - 1760F_p13) was 10 times higher than that of HEV wild strain (JE03 -1760F_p13) after inoculation with PLC/PRF/5 cells and release into culture medium. A culture line of HEV type 4 (HE-JF5/15F) strain was established by inoculating patients with severe hepatitis E with fecal suspension. JE03 - 1760F strain was identified in the same culture medium as HE-JF5/15F strain, and its infectivity was detected in the culture medium of 6 passages. The presence of HE-JF5/15F strain in the culture supernatant was confirmed 2 days after inoculation, and the amount of HE-JF5/15F strain reached 1.5 x 10^8 copies/ml 10 days after inoculation. HE-JF5/15F_p6 is a novel gene that can be used to express the genes of ORF1, ORF2 and ORF 10. 2)9 kinds of antigen protein, immunogen and antibody The binding energy of HEV particles is strong, and the infection prevention energy (neutralization activity) is strong. 24-mer synthesis of the C-terminal equivalent of HEVORF3 protein. ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6, ORF7, ORF8, ORF9, ORF9, ORF 3)HEV particles released from culture supernatant, HEV particles in glucose solution, HEV particles in feces, HEV particles in glucose solution, HEV particles in urine, HEV particles in urine, HEV particles, HEV particles in urine, HEV particles in urine, HEV (1.26-1.27 g/ml), different surface membrane components, ORF3 protein, different surface membrane components, ORF3 protein, different surface membrane components, ORF3 protein, different surface active components, different surface active components, different surface active components, 4)A549 cell line, PLC/PRF/5 cell line, faecal-derived wild strain (JE03 - 1760F) and infectious cDNA library (pJE03 - 1760F/wt) with equivalent infectious and reproductive activity were constructed. Add ATG to ORF3 and replace it with GCA (pJE03 - 1760F/ΔORF3). Inoculate cells in culture. Infect cells. HEV RNA in cells was detected in culture supernatant, but not in cells with ORF3 deficiency. In this study, the function of ORF3 protein is unknown. It is necessary for HEV particles to be released. It is necessary for HEV particles to be released. It is necessary for cell membrane components to be constructed. The results of this study include the control of HEV infection, the establishment of breeding mechanisms and the release of mechanisms.

项目成果

Analysis of the full-length genome of hepatitis E virus isolates obtained from farm pigs in Mongolia

• DOI: 10.1002/jmv.20905
• 发表时间: 2007-08-01
• 期刊: JOURNAL OF MEDICAL VIROLOGY
• 影响因子: 12.7
• 作者: Lorenzo, Felipe R.;Tsatsralt-Od, Bira;Okamoto, Hiroaki
• 通讯作者: Okamoto, Hiroaki

Construction of an Infectious Cdna Clone of Hepatitis E Virus Strain Je03-1760f That Can Propagate Efficiently in Cultured Cells

戊型肝炎病毒株 Je03-1760f 感染性 cdna 克隆的构建，可在培养细胞中高效传播

• 发表时间: 2008
• 作者: Kentaro Yamada;Masaharu Takahashi;Yu Hoshino;Hideyuki Takahashi;K. Ichiyama;Toshinori Tanaka;Hiroaki Okamoto Correspondence;Hiroaki Okamoto
• 通讯作者: Hiroaki Okamoto

Sporadic acute hepatitis E occurred constantly during the last decade in northeast Japan

• DOI: 10.1007/s00535-009-0012-3
• 发表时间: 2009-03
• 期刊: Journal of Gastroenterology
• 影响因子: 6.3
• 作者: J. Inoue;Y. Ueno;F. Nagasaki;T. Akahane;K. Fukushima;T. Kogure;Y. Kondo;Eiji Kakazu;Keiichi Tamai;Osamu Kido;Y. Nakagome;M. Ninomiya;Noriyuki Obara;Yuta Wakui;Masaharu Takahashi;H. Okamoto;T. Shimosegawa

Viral genotyping/sequencing の臨床的意義Genotype 4 のE 型肝炎ウイルスの全長塩基配列の解析による劇症化に関連する塩基の同定

病毒基因分型/测序的临床意义 通过分析基因型 4 戊型肝炎病毒的全长碱基序列鉴定与暴发性疾病相关的碱基

• 发表时间: 2008
• 作者: 井上淳;上野義之;岡本宏明
• 通讯作者: 岡本宏明

肝炎ウイルス研究のカッティングエッジ 基礎から臨床への贈り物 E 型肝炎ウイルス研究の進歩

肝炎病毒研究的前沿 从基础到临床实践的礼物 戊型肝炎病毒研究进展

• 发表时间: 2008
• 作者: Kuwajima;S.;岡本宏明
• 通讯作者: 岡本宏明