Molecular mechanisms underlying Ca2^<+>-dependent facilitation and inactivation of L-type Ca^<2+> channels

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本研究は、L型Caチャネル活動に対するCaMやCaMKIIの作用機序をCa依存性促通と不活性化との関連で解明することを目的として実施された。CaMについては、これ迄の研究で、CaMがL型Caチャネルα1サブユニット(Cav1.2)のN末部(NT)、リピートI-II間の細胞内ループ(LI-II)、C末部のIQモチーフ領域(IQ)およびpre-IQ領域(CB)を含む近位部(CT1)に結合することが判明している。本研究では、CaチャネルのNT、LI-IIおよびCT1領域へのCaM結合のCa依存性についてpull-down法で検討した。CaMのNT、LI-IIおよびCT1への結合の親和性はCa濃度の高低両条件下で、CT1>NT>LI-IIであった。これより、CaM結合の親和性はCa濃度に関わらずCT1が最も高く、この部位がチャネル活性のCaMによる調節に最も重要であることが示唆された。一方、モルモット単一心筋細胞を用いたパッチクランプ実験では、CaMおよびCa結合能を消失させた変異CaM(CaM_(1234))がcell-free状態(inside-outパッチ)によりrundownさせたCaチャネル活性を濃度依存的に回復させることが判明した。このチャネル活性化作用は野生型CaMではCa^(2+)依存性を示したが、CaM_(12)(N-lobeのCa結合能を無くした変異体)、CaM_(34)(C-lobeのCa結合能を無くした変異体)、CaM_(1234)ではCa^(2+)非依存性であった。これより、CaMのCa依存性作用には、N-lobeとC-lobeとの両者が必要であると示唆された。さらに、Caチャネルに対するCaMKIIの作用についても検討した。その結果、チャネルC末部にCaMKIIのリン酸化部位があること、同部位のリン酸化によりCaMの結合が増加することが判明した。これらの結果は、Caイオン、CaM、CaMKIIが複雑かつ協調的に作用してL型Caチャネルの活動を調節していることを示している。また、Ca依存性促通にはCa^(2+)/CaMの直接作用とCaMKIIによるリン酸化の両者が関与し、不活性化には主にCa2+/CaMが関与するという仮説を支持する。