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成人T細胞白血病におけるマイクロRNAmiR-146aおよびmiR-155の役割

microRNA miR-146a 和 miR-155 在成人 T 细胞白血病中的作用

基本信息

批准号：
21591212
负责人：
富田真理子
金额：
$ 2.33万
依托单位：
University of the Ryukyus
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2011
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21591212/
关键词：
ウイルスがんシグナル伝達 HTLV-1 マイクロRNA

项目摘要

成人T細胞白血病(ATL)はヒトT細胞白血病ウイルス1型(HTLV-1)感染を原因とする予後不良のリンパ系悪性腫瘍で、ATL発症の分子機構に基づく新規治療法の開発が切望されている。最近の研究で、マイクロRNAの発現異常と癌の発生・進展との関連が示唆されているが、マイクロRNAの発現制御の分子機構や標的遺伝子に関しては未知の点が多く、ATL発症との関連を検討した報告は無い。我々はこれまでに、HTLV-1感染T細胞株におけるマイクロRNA発現を網羅的に解析した結果、非感染T細胞株と比較して発現に違いのあるマイクロRNAを同定した。本年度は、発現に異常の見られたマイクロRNAのうちmiR-146aに焦点を絞って解析を行った。1.HTLV-1感染T細胞におけるmiR-146a発現解析:HTLV-1トランスフォームT細胞株5種類、ATL患者由来T細胞株3種類およびHTLV-1非感染T細胞株3種類より15-30塩基の短鎖RNAを含む全RNAを抽出した。ATL患者、HTLV-1キャリアおよび健常人の末梢血単核球からは磁気マイクロビーズを用いてCD4陽性T細胞を分離し全RNAを抽出した。抽出した全RNAを用い定量リアルタイムRT-PCR法でmiR-146aの発現を解析した。2.HTLV-1感染、Taxの発現、病型、予後との相関の解析:定量リアルタイムRT-PCRの結果からmiR-146a発現とHTLV-1感染やTax発現との相関、健常人とのマイクロRNA発現パターンの違いを検討した。1および2の解析の結果、HTLV-1感染やTax発現とmiR-146a発現との間に有意な相関が見られたので、3.HTLV-1感染によるmiR-146a発現誘導機構の解析を行った。(1)TaxによるmiR-146a発現増強効果の検討:JPX-9細胞(メタロチオネインプロモーターの下流にTax cDNAをつないだプラスミドをHTLV-1非感染T細胞株Jurkatに遺伝子導入した細胞株で、培養液中に塩化カドミウムを添加するとTaxの発現が誘導できる)を用いて、Tax発現によりmiR-146a発現が誘導されるかTaqManプローブを用いた定量リアルタイムRT-PCR法で検討した。その結果、Taxによる発現誘導が認められたため、さらに(2)、Taxによる転写因子活性化とmiR-146a発現誘導の関連を検討した。miR-146a発現を制御するプロモーター領域をルシフェラーゼ遺伝子の上流に組み込んだレポータープラスミドを作成して、TaxがmiR-146a遺伝子の転写活性化に及ぼす影響をルシフェラーゼアッセイで検討した。さらに、プロモーター上のNF-kBおよびAP-1転写因子結合部位に部位特異的変異導入法で変異を導入しTaxによるマイクロRNA遺伝子転写活性化への関与を解析した。また、HTLV-1感染および非感染T細胞から核抽出液を調整し、NF-kBおよびAP-1とプロモーター上の転写因子結合部位との結合をゲルシフト法で解析した。その結果、TaxによるmiR-146a遺伝子発現誘導には2カ所のNF-kB結合部位のうち近位のNF-kB結合部位が重要であることが明らかになった。さらに、miR-146aの機能を特異的に阻害するマイクロRNA阻害剤を細胞に導入するとHTLV-1感染細胞特異的に細胞増殖を抑制した。以上の結果から、TaxによってNF-kB依存的に発現が誘導されるmiR-146aはHTLV-1感染細胞の増殖を促進していることが明らかになった。次年度は、miR-155についても同様の解析を行う予定である。

Causes of adult T-cell leukemia (ATL) T-cell leukemia type 1 (HTLV-1) infection After the adverse disease is caused by the disease, the molecular structure of the ATL disease is based on the new regulation of the treatment method. Recent research has shown that abnormality in マイクロRNA is related to the development and progress of cancer, and マイクロRNA is related to The molecular structure of the current control system is unknown and the target remains unknown, and the ATL disease is related and the report is not reported. I am a HTLV-1-infected T-cell strain, a HTLV-1-infected T-cell strain, and a RNA-based RNA detection system. Analyze the results and compare the results of non-infected T cell lines and compare them with each other. This year, there is an abnormality in the abnormality of RNA and RNA-146a. 1. Analysis of the occurrence of HTLV-1 infected T cells and miR-146a: 5 types of HTLV-1 T cell lines, ATL patients The origin of the T cell strain is 3 kinds of HTLV-1 non-infectious T cell strain 3 kinds of より15-30 short-locked RNA containing all RNA extracted. ATL patients, HTLV-1 キャリアおよびjian normal people's peripheral blood single nuclear sphere からは magnetic プマイクロビーズを isolating and extracting whole RNA from いてCD4-positive T cells. The whole RNA was extracted and analyzed using quantitative RT-PCR method of miR-146a. 2. Analysis of the correlation between HTLV-1 infection, Tax manifestation, disease type, and treatment outcome: Quantitative RT-PCR results and miR -146a is related to HTLV-1 infection and is related to healthy people. 1および2のanalytical results, HTLV-1 infection, Taxation, miR-146a appearance, and interest in the room. Related analysis and analysis of HTLV-1 infection and the induction mechanism of miR-146a. (1) Tax on the enhanced effect of miR-146a: JPX-9 cells cDNA をつないだプラスミドをHTLV-1 non-infectious T cell strain Jurkat に伝子 was introduced into the した cell strain で, and the カドミウムを added into the culture medium するとTax の発appearがinducingできる)を用いて、Tax発appearによりmiR-146a発appearがinducingされるThe TaqMan Lab was developed using the TaqMan quantitative TaqRay RT-PCR method.その results, Tax による発appearance-induced がcognition められたため, さらに(2), Tax による転activation of writing factors, and miR-146a 発appearance-induced のcorrelation を検 Discussion した. The control of miR-146aみ込んだレポータープラスミドを成して、TaxがmiR-146a remains 伝子の転WRITE activated に and ぼすeffect をルシフェラーゼアッセイで検した. NF-kB NF-kB AP-1 phosphorus factor binding site site-specific differences The import method is different from that of importing and activating RNA and analyzing it.また, HTLV-1 infected および non-infected T cells から nuclear aspirate を adjustment し, NF-kB およびAP-1とプロモーター上の転Write the factor binding site とのcombination をゲルシフト法でanalytic した.そのRESULTS、TaxによるmiR-146a remains 伝子発 appear to induce には2カSOのNF-k The B-binding site is close to the NF-kB binding site and the B-binding site is important. The function of miR-146a is to specifically inhibit the introduction of RNA into HTLV-1-infected cells and specifically inhibit cell proliferation. The results of the above are: Tax and NF-kB-dependent induction of NF-kB- 146a promotes the proliferation of HTLV-1-infected cells. In the following year, the analysis and analysis of miR-155 will be determined.