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インフルエンザRNAポリメラーゼ PA－PB1立体構造による抗ウイルス剤の開発

基于流感RNA聚合酶PA-PB1三维结构开发抗病毒药物

基本信息

批准号：
10J07507
负责人：
吉田尚史
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Yokohama City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2012
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10J07507/
关键词：
インフルエンザウイルス RNAポリメラーゼ新規薬剤開発

项目摘要

本研究はインフルエンザウイルスに対する新規薬剤開発を目指し、ウイルス増殖の中心的役割を果たしているインフルエンザRNAポリメラーゼのPA-PB1サブユニットに対して、結合阻害剤のスクリーニングを行ってきた。研究計画通り、(1)コンピューターレベル(2)タンパク質レベル(3)細胞レベルの3段階に分けて研究を進めてきた。まずRNAポリメラーゼPA-PB1の立体構造を基にin-silicoスクリーニングを行い、数千種類の化合物を阻害剤の候補として算出した。次に、これらの化合物が実際にタンパク質間相互作用を阻害するか溶液中で調べたところ、数種類の化合物について阻害効果が認められた。また、PAタンパク質と化合物との解離定数をITCによって算出した。さらに、これらの化合物のうち数個は、細胞毒性がなくウイルス増殖に対して抑制効果をもつことを確認した。これらの結果を踏まえ平成24年度では主に、X線結晶構造解析法によるPAタンパク質と化合物との結合様式の解明を目的とし、研究を行った。複合体構造の解析には、PA単体の結晶に化合物を浸漬し結合させる方法と、PAと化合物を混合し、結晶化する方法の2通りが考えられた。そこで結晶化前に、PA単体と化合物との複合体それぞれについて、超遠心分析を行った。その結果、PA単体と化合物複合体ではピークの変化が観測されたことから、化合物が結合することにより分子の構造が大きく変化することが示唆された。すなわち、化合物を浸漬する方法では、化合物の結合に伴い分子構造が変化してしまい、結晶が壊れてしまう可能性があり、この方法は不適であると考えられた。そのため、PAと化合物をモル比1:1で混合し、共結晶化を行ったが、構造解析に適した結晶を得ることはできなかった。次に、タンパク質の結晶化を促進させるために、抗体を用いて再度結晶化を行った。まず、PAタンパク質を抗原として、抗体の作製を行い、得られた抗体をPA-化合物複合体に結合させ、3者複合体として共結晶化を行った。その結果、いくつかの条件で結晶が得られ、放射光施設、高エネルギー加速器研究機構においてX線回折実験を行ったところ、最高8A付近までの反射を確認することができた。

In this study, PA-PB1 was developed to target new drug development and to target new drug development. The research plan includes: (1) three stages of cell culture;(2) three stages of cell culture; The three-dimensional structure of PA-PB1 was calculated by in-silico method, and thousands of compounds were calculated as potential inhibitors. In addition, these compounds have been found to inhibit mass-to-mass interactions in solution, and several compounds have been found to inhibit effects. The number of dissociations of the compounds was calculated. In addition, several of these compounds were identified as cytotoxic agents for their proliferation and inhibition effects. In 2004, the main and X-ray crystal structure analysis methods were used to clarify the binding formula of PA compounds. Analysis of complex structure, PA monomer crystallization, compound impregnation, bonding, PA compound mixing, crystallization, and other methods Before crystallization, PA monomer, compound and complex were analyzed by ultra-telecentric analysis. As a result, PA units and compound complexes are characterized by their molecular structure. The method of impregnation of the compound is different from that of the combination of the compound and the molecular structure. The possibility of crystallization is different from that of the method. 1:1 mixing, co-crystallization, structural analysis, crystallization Second, the crystallization of the protein is promoted, and the re-crystallization of the protein is carried out. PA-compound complex binding, PA-compound complex co-crystallization Results, conditions, crystallization, radiation, accelerator research institutions, X-ray reflection, reflection of the highest 8A close to the confirmation.