エンドサイトーシスにおける受容体輸送の時空間的制御機構の解明

本年度計画に沿って以下の研究を実施した。1つ目の研究課題である「受容体がクラスリン小胞へ取り込まれる機構の解析」については、まず受容体(酵母フェロモンα-factorの受容体であるSte2p)のリン酸化、ユビキチン化変異体の解析(研究計画1-1)を行った。その結果、活性化した受容体のクラスリン小胞への移動には、リン酸化とユビキチン化の両方が必要であるが、リン酸化よりもユビキチン化の方が重要であり、ユビキチン化されたSte2pはユビキチン結合モチーフであるUIMもしくはUBAを有すEnt1/2pおよびEde1pと結合することにより、クラスリン被覆小胞に取り込まれエンドサイトーシスされることが明らかとなった。一方、Ste2pのリン酸化の生物学的意義を明らかにするため、エンドサイトーシス関連蛋白質の中にSte2pのリン酸化型特異的に結合する蛋白質がないかを調べた(研究計画1-2)。Ste2pのリン酸化型変異体(Ste2-6SD)のC末端領域を酵母ツーハイブリッドシステムのベイトとして用い、酵母ゲノムライブラリーを用いてスクリーニングを行った結果、哺乳類14-3-3蛋白質酵母ホモログであるBmh2pを結合タンパク質として同定した。Bmh2pによるSte2pのリン酸化の制御について現在解析を続けている。2つ目の研究課題である、「クラスリン小胞の初期エンドソームへの輸送機構の解明」については、初期エンドソームを特異的に標識するマーカーの作製を試みた(研究計画2-1)。エンドソーム(初期、後期、多胞体、輸送を含む)に局在することが明らかとなっているYpt52p、Tlg2pのN末端、またVps10p, Vps4p, Vps26pのC末端にGFPを付加し、その局在を調べた。その結果、これらは全てエンドソーム様の小胞に局在することが分かった。現在これらの局在を既存のオルガネラマーカーと比較することで、これらのタンパク質が局在する場所の同定を行っている。一方、クラスリン被覆小胞とエンドソームの会合に異常のある変異体の解析(研究計画2-2)については、Alexa-α-factorを用いた出芽酵母の全遺伝子(約6000個)を対象とした網羅的なスクリーニングを開始した。これまで110個の遺伝子欠損変異体を調べ、5種類の変異体でAlexa-α-factorの取り込み、または輸送に異常が認められた。残りの遺伝子について、現在引き続きスクリーニングを行っている。

本年度計画に沿って以下の研究を実施した。1つ目の研究課題である「受容体がクラスリン小胞へ取り込まれる機構の解析」については、まず受容体(酵母フェロモンα-factorの受容体であるSte2p)のリン酸化、ユビキチン化変異体の解析(研究計画1-1)を行った。その結果、活性化した受容体のクラスリン小胞への移動には、リン酸化とユビキチン化の両方が必要であるが、リン酸化よりもユビキチン化の方が重要であり、ユビキチン化されたSte2pはユビキチン結合モチーフであるUIMもしくはUBAを有すEnt1/2pおよびEde1pと結合することにより、クラスリン被覆小胞に取り込まれエンドサイトーシスされることが明らかとなった。一方、Ste2pのリン酸化の生物学的意義を明らかにするため、エンドサイトーシス関連蛋白質の中にSte2pのリン酸化型特異的に結合する蛋白質がないかを調べた(研究計画1-2)。Ste2pのリン酸化型変異体(Ste2-6SD)のC末端領域を酵母ツーハイブリッドシステムのベイトとして用い、酵母ゲノムライブラリーを用いてスクリーニングを行った結果、哺乳類14-3-3蛋白質酵母ホモログであるBmh2pを結合タンパク質として同定した。Bmh2pによるSte2pのリン酸化の制御について現在解析を続けている。2つ目の研究課題である、「クラスリン小胞の初期エンドソームへの輸送機構の解明」については、初期エンドソームを特異的に標識するマーカーの作製を試みた(研究計画2-1)。エンドソーム(初期、後期、多胞体、輸送を含む)に局在することが明らかとなっているYpt52p、Tlg2pのN末端、またVps10p, Vps4p, Vps26pのC末端にGFPを付加し、その局在を調べた。その結果、これらは全てエンドソーム様の小胞に局在することが分かった。現在これらの局在を既存のオルガネラマーカーと比較することで、これらのタンパク質が局在する場所の同定を行っている。一方、クラスリン被覆小胞とエンドソームの会合に異常のある変異体の解析(研究計画2-2)については、Alexa-α-factorを用いた出芽酵母の全遺伝子(約6000個)を対象とした網羅的なスクリーニングを開始した。これまで110個の遺伝子欠損変異体を調べ、5種類の変異体でAlexa-α-factorの取り込み、または輸送に異常が認められた。残りの遺伝子について、現在引き続きスクリーニングを行っている。