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エンドサイトーシスにおける受容体輸送の時空間的制御機構の解明

阐明胞吞过程中受体转运的时空控制机制

基本信息

批准号：
10J40043
负责人：
十島純子
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Tokyo University of Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2011
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10J40043/
关键词：
エンドサイトーシス受容体エンドソームアクチン細胞骨格

项目摘要

本年度計画に沿って以下の研究を実施した。1つ目の研究課題である「受容体がクラスリン小胞へ取り込まれる機構の解析」については、まず受容体(酵母フェロモンα-factorの受容体であるSte2p)のリン酸化、ユビキチン化変異体の解析(研究計画1-1)を行った。その結果、活性化した受容体のクラスリン小胞への移動には、リン酸化とユビキチン化の両方が必要であるが、リン酸化よりもユビキチン化の方が重要であり、ユビキチン化されたSte2pはユビキチン結合モチーフであるUIMもしくはUBAを有すEnt1/2pおよびEde1pと結合することにより、クラスリン被覆小胞に取り込まれエンドサイトーシスされることが明らかとなった。一方、Ste2pのリン酸化の生物学的意義を明らかにするため、エンドサイトーシス関連蛋白質の中にSte2pのリン酸化型特異的に結合する蛋白質がないかを調べた(研究計画1-2)。Ste2pのリン酸化型変異体(Ste2-6SD)のC末端領域を酵母ツーハイブリッドシステムのベイトとして用い、酵母ゲノムライブラリーを用いてスクリーニングを行った結果、哺乳類14-3-3蛋白質酵母ホモログであるBmh2pを結合タンパク質として同定した。Bmh2pによるSte2pのリン酸化の制御について現在解析を続けている。2つ目の研究課題である、「クラスリン小胞の初期エンドソームへの輸送機構の解明」については、初期エンドソームを特異的に標識するマーカーの作製を試みた(研究計画2-1)。エンドソーム(初期、後期、多胞体、輸送を含む)に局在することが明らかとなっているYpt52p、Tlg2pのN末端、またVps10p, Vps4p, Vps26pのC末端にGFPを付加し、その局在を調べた。その結果、これらは全てエンドソーム様の小胞に局在することが分かった。現在これらの局在を既存のオルガネラマーカーと比較することで、これらのタンパク質が局在する場所の同定を行っている。一方、クラスリン被覆小胞とエンドソームの会合に異常のある変異体の解析(研究計画2-2)については、Alexa-α-factorを用いた出芽酵母の全遺伝子(約6000個)を対象とした網羅的なスクリーニングを開始した。これまで110個の遺伝子欠損変異体を調べ、5種類の変異体でAlexa-α-factorの取り込み、または輸送に異常が認められた。残りの遺伝子について、現在引き続きスクリーニングを行っている。

This year's plan is based on the following research and implementation. 1. Research project of the project "Analysis of the structure of the acceptor small cells" については、まずReceiver (yeast フェロモAnalyzes of α-factor acceptor (Ste2p) and acidification of α-factor (research project 1-1).その results, activation of the receptor, のクラスリン cells, へのmovement, リン acidification, とユビキチン化の両方が必であるが、リン acidified よりもユビキチン化の方がimportant であり、ユビキチン化されたSte2pはユビキチン合モチーフであるUIMもしくはUBAを有すEnt1/2pおよびEde1pとcombinationすることにより, クラスリン coated cells に取り込まれエンドサイトーシスされることが明らかとなった. One side, the biological significance of the acidification of Ste2p, the related protein of Ste2p Ste2p のリン acidification type specific に binding protein がないかを Adjustment べた (Research Project 1-2). The C-terminal domain of Ste2p's acidified variant (Ste2-6SD) Yeast starter, yeast starterラリーを用いてスクリーニングを行ったRESULTS, Mammalian 14-3-3 eggs Albumin yeast ホモログであるBmh2pを combined with タンパク色として同定した. Bmh2p によるSte2p のリン acidification のcontrol についてNow analyze を続けている. 2. Research project of the project, "Explanation of the initial stage of the クラスリン cell's transport mechanism"いては, Initial エンドソームをSpecial に logo, するマーカーの, was produced and tested (Research Project 2-1).エンドソーム(Initial stage, late stage, polytope, transport をcontaining む) is in することが明らかとなっているYpt52p, Tlg2pのN terminus, またVps10p, Vps4p, Vps26p's C-terminal GFP is added and the bur is adjusted.そのRESULTS, これらは全てエンドソーム様の小cellにBureau in することが分かった. Now the game is in the same place as the existing one.で. One, Alex The a-α-factor is made from the whole body of budding yeast (approximately 6,000 pcs) and is collected from the なスクリーニングを.これまで110 pieces of の弝子无礉variantを Adjustmentべ, 5 kinds of の変variant でAlexa-α-factorのGETり込み, またはTransmissionにAbnormalがcognizeめられた. The remaining part of the story is the について, and now the き続きスクリーニングを行っている.