エンドサイトーシスにおける受容体輸送の時空間的制御機構の解明

阐明胞吞过程中受体转运的时空控制机制

基本信息

批准号：
10J40043
负责人：
十島純子
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Tokyo University of Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2011
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10J40043/
关键词：
エンドサイトーシス受容体エンドソームアクチン細胞骨格

项目摘要

本年度計画に沿って以下の研究を実施した。1つ目の研究課題である「受容体がクラスリン小胞へ取り込まれる機構の解析」については、まず受容体(酵母フェロモンα-factorの受容体であるSte2p)のリン酸化、ユビキチン化変異体の解析(研究計画1-1)を行った。その結果、活性化した受容体のクラスリン小胞への移動には、リン酸化とユビキチン化の両方が必要であるが、リン酸化よりもユビキチン化の方が重要であり、ユビキチン化されたSte2pはユビキチン結合モチーフであるUIMもしくはUBAを有すEnt1/2pおよびEde1pと結合することにより、クラスリン被覆小胞に取り込まれエンドサイトーシスされることが明らかとなった。一方、Ste2pのリン酸化の生物学的意義を明らかにするため、エンドサイトーシス関連蛋白質の中にSte2pのリン酸化型特異的に結合する蛋白質がないかを調べた(研究計画1-2)。Ste2pのリン酸化型変異体(Ste2-6SD)のC末端領域を酵母ツーハイブリッドシステムのベイトとして用い、酵母ゲノムライブラリーを用いてスクリーニングを行った結果、哺乳類14-3-3蛋白質酵母ホモログであるBmh2pを結合タンパク質として同定した。Bmh2pによるSte2pのリン酸化の制御について現在解析を続けている。2つ目の研究課題である、「クラスリン小胞の初期エンドソームへの輸送機構の解明」については、初期エンドソームを特異的に標識するマーカーの作製を試みた(研究計画2-1)。エンドソーム(初期、後期、多胞体、輸送を含む)に局在することが明らかとなっているYpt52p、Tlg2pのN末端、またVps10p, Vps4p, Vps26pのC末端にGFPを付加し、その局在を調べた。その結果、これらは全てエンドソーム様の小胞に局在することが分かった。現在これらの局在を既存のオルガネラマーカーと比較することで、これらのタンパク質が局在する場所の同定を行っている。一方、クラスリン被覆小胞とエンドソームの会合に異常のある変異体の解析(研究計画2-2)については、Alexa-α-factorを用いた出芽酵母の全遺伝子(約6000個)を対象とした網羅的なスクリーニングを開始した。これまで110個の遺伝子欠損変異体を調べ、5種類の変異体でAlexa-α-factorの取り込み、または輸送に異常が認められた。残りの遺伝子について、現在引き続きスクリーニングを行っている。

以下研究按照今年的计划进行。关于第一个研究主题，“对受体被吸收到网格蛋白囊泡的机制的分析”，我们首先对受体的泛素化突变体进行了磷酸化和分析（Ste2p，酵母网络上的受体α-因子的受体）（研究设计1-1）。 As a result, both phosphorylation and ubiquitination are required for the transfer of activated receptors to clathrin vesicles, but ubiquitination is more important than phosphorylation, and ubiquitinated Ste2p is incorporated into clathrin-coated vesicles and endocytate by binding to UIM or Ent1/2p and Ede1p, which have ubiquitin binding motifs, UIM or UBA.另一方面，为了阐明Ste2p磷酸化的生物学意义，我们研究了是否存在一种蛋白质在与内吞作用相关蛋白之间特异性结合Ste2p的磷酸化形式（研究设计1-2）。 Ste2p（Ste2-6SD）的磷酸化突变体的C末端区域用作酵母两杂交系统的诱饵，并使用酵母基因组文库和BMH2P（哺乳动物14-3-3-3蛋白酵母同源物）筛选为结合蛋白。我们目前正在继续分析BMH2P对Ste2P磷酸化的调节。关于第二个研究主题，“了解网格蛋白囊泡对早期内体的运输机制”，我们试图创建一个专门标记早期内体的标记（研究设计2-1）。将GFP添加到YPT52P和TLG2P的N端，它们显然位于内体（包括早期，晚期，多重词和运输），以及VPS10P，VPS4P和VPS26P的C-末端，并检查其本地化。结果表明，所有这些都位于内体样囊泡上。当前，将这些本地化与现有细胞器标记进行比较，以确定这些蛋白质的位置。另一方面，为了分析网格蛋白涂层囊泡和内体之间具有异常关联的突变体（研究设计2-2），我们使用Alexa-α因子开始对所有基因（约6,000个基因）的详尽筛查。到目前为止，已经研究了110个基因缺陷突变体，并且有5个突变体发现Alexa-α因子的摄取或运输异常。目前正在筛选其余基因。