真核細胞で見つかった新規走化性シグナル伝達経路の１分子解析

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本研究では近年同定した新たな走化性シグナル伝達経路について生細胞の一分子観察を行い、細胞の時空間的情報処理機構を解明することを目的とする。この経路は低分子量Gタンパク質RasCを介したTarget of Rapamycin Complex 2 kinase(TorC2)-Protein Kinase B(PKB)経路で、TorC2(Tor、Lst8、PiaA、Rip3のサブユニットから構成)がPKBR1をリン酸化することで活性化に導く。また、RasCはその特異的グアニンヌクレオチド交換因子AleA複合体により活性化される。これらの分子の動態を1分子レベルで解析するための標識としてHaloTagを用いた。HaloTagを介して、GFPよりも安定な有機蛍光色素であるテトラメチルローダミンを目的タンパク質特異的に付加できる。これまでにRasC、AleA、Lst8、PiaA、Rip3、PKBR1にHaloTagを融合した発現プラスミドを構築した。破壊株を用いた機能相補実験から、PKBR1、AleA、Lst8のHaloTag融合タンパク質は正常に機能したが、RasC、PiaA、Rip3はタグを融合した影響でそれらの機能を喪失した。正常に機能したものについてローダミンを付加し全反射照明蛍光顕微鏡を用いた観察を行った。これらのうち、PKBR1について細胞膜上での一分子観察が可能となった。現在、データの更なる取得と平行して、統計解析を行い細胞膜滞在時間(解離速度定数)と二次元拡散係数のパラメータ導出を行っている。