生理的条件でのシグナル伝達の分子構造を見るための新規一分子標識法の開発

开发一种新颖的单分子标记方法来观察生理条件下信号转导的分子结构

• 批准号: 11J02327
• 负责人: 松永 幸子
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2011
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2011 至 2013-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J02327/
• 关键词: 1分子標識法; 分子間相互作用解析; ハイスループットスクリーニング

本課題研究は生理的な条件での分子間相互作用や細胞応答を解析し、その分子構造を見ることを目指している。すなわち、生細胞上で起こる実際の分子の変化を目で見られるようにするものである。そのために、cutinaseという真菌由来セリンプロテアーゼ様酵素およびその自殺型基質p-nitrophenylphosphonate(pNPP)を用い、標的蛋白質を部位特異的かつ共有結合的に標識する方法の開発に取り組んできた。初年度であった昨年度は、cutinase融合蛋白質を用いた受容体-リガンド結合を検出するために、種々の"pNPP-プローブシリーズ"の作製から取り掛かり、ビオチン,蛍光物質Alexa488-,Alexa546-,Alexa594-Fluor,pH感受性蛍光物質CypHer5Eに対してpNPPを結合させた5つのpNPP-プローブを合成した。これらのpNPP-プローブを用い、生細胞上での一段階分子標識を行った。さらに、発現や精製が困難なリガンド蛋白質(Dkk1やsemaphorin)に着目し、微量に発現した未精製の発現培養上清を用いるだけで、生細胞上に発現させた受容体(結合パートナー)との相互作用を簡便に検出することを可能にした。実際に取り組んだ実験を以下に示す。(1)細胞膜表面に発現している膜蛋白質LRP6の標識と、LRP6細胞内在化の時間追跡(2)LRP6とそのリガンド分子Dkk1との相互作用解析と、変異体を用いた相互作用ドメインの同定(3)Semaphorinファミリー蛋白質の受容体Plexinや補助受容体Neuropilinに対する結合解析(4)Semaphoring-Plxin間結合を検出するハイスループットスクリーニングアッセイ系の確立(5)抗体産生ハイブリドーマ細胞培養上清のスクリーニング法の確立

This topic research は physiological conditions of な で の intermolecular interactions や cells 応 answer を analytical し, そ の molecular structure を see る こ と を refers し て い る. Youdaoplaceholder0, で on the living cells, <s:1> る actual <s:1> molecular <e:1> changes を are seen で, られるようにする で である である である である. そ の た め に, cutinase と い う fungal origin セ リ ン プ ロ テ ア ー ゼ others in enzyme お よ び そ の suicide type matrix p - nitrophenylphosphonate (pNPP) を い, target protein を site specific か つ mutual combination of に logo す る method の open 発 に group take り ん で き た. At the beginning of the annual で あ っ た yesterday annual は, cutinase fusion protein を い た by let body - リ ガ ン ド combining を 検 out す る た め に, kind of 々 の "pNPP - プ ロ ー ブ シ リ ー ズ" の cropping か ら り placed か り, ビ オ チ ン, 蛍 Alexa488 - light substances, Alexa546 -, Alexa594 - Fluor PH sensitivity, 蛍 light material CypHer5E に し seaborne て pNPP を combining さ せ た 5 つ の pNPP - プ ロ ー ブ を synthetic し た. <s:1> れら <s:1> pNPP-プロ プロ ブを ブを ブを is marked with を rows of った by the で <s:1> first-order molecule on the living cell. さ ら に, difficulty 発 now や refined が な リ ガ ン ド protein (Dkk1 や semaphorin) with mesh し に, trace に 発 now し た unrefined の 発 practice while culture supernatant を い る だ け で, born on cells に 発 now さ せ た by let body (a combination of パ ー ト ナ ー) と の easy interaction を に 検 out す る こ と を may に し た. In reality, に is taken from the んだ group. In reality, を is shown as に below. (1) the cell membrane surface に 発 now し て い る membrane protein LRP6 の identification と, LRP6 cellular internalization の time tracing (2) the LRP6 と そ の リ ガ ン ド molecular Dkk1 と の analytical と interaction, 1 - を い た interaction ド メ イ ン の with constant (3) Semaphorin フ ァ ミ リ ー protein の Plexi let body N や subsidies by the capacity of body Neuropilin に す seaborne る combines analytic (4) the combination between Semaphoring - Plxin を 検 out す る ハ イ ス ル ー プ ッ ト ス ク リ ー ニ ン グ ア ッ セ イ is の established (5) antibodies ハ イ ブ リ ド ー マ cell culture supernatant の ス ク リ ー ニ ン の グ method established

项目成果

Vascular endothelial growth factor (VEGF)-enhanced vascular permeability via VEGF receptor-2 selectively form fenestrae ultrastructure in endothelium

血管内皮生长因子 (VEGF) 通过 VEGF 受体 2 增强血管通透性，选择性在内皮细胞中形成窗孔超微结构

• 发表时间: 2011
• 作者: Yukiko Matsunaga;Yasuo Yamazaki;Hidenori Suzuki;Takashi Morita
• 通讯作者: Takashi Morita

Cutinase融合タンパク質を用いた分子標識と生細胞イメージング:Dkk1-LRP6相互作用ドメインの同定

使用角质酶融合蛋白进行分子标记和活细胞成像：鉴定 Dkk1-LRP6 相互作用结构域

• 发表时间: 2011
• 作者: 松永幸子;他
• 通讯作者: 他

Cutinaseタグを用いた生細胞での分子間相互作用解析

使用角质酶标签进行活细胞中的分子相互作用分析

• 发表时间: 2012
• 作者: 松永幸子;岩崎憲治;高木淳一
• 通讯作者: 高木淳一

In situ visualization and dynamics of internalized membrane proteins

内化膜蛋白的原位可视化和动力学

• 发表时间: 2011
• 作者: 松永幸子;他
• 通讯作者: 他