生理的条件でのシグナル伝達の分子構造を見るための新規一分子標識法の開発

本課題研究は生理的な条件での分子間相互作用や細胞応答を解析し、その分子構造を見ることを目指している。すなわち、生細胞上で起こる実際の分子の変化を目で見られるようにするものである。そのために、cutinaseという真菌由来セリンプロテアーゼ様酵素およびその自殺型基質p-nitrophenylphosphonate(pNPP)を用い、標的蛋白質を部位特異的かつ共有結合的に標識する方法の開発に取り組んできた。初年度であった昨年度は、cutinase融合蛋白質を用いた受容体-リガンド結合を検出するために、種々の"pNPP-プローブシリーズ"の作製から取り掛かり、ビオチン,蛍光物質Alexa488-,Alexa546-,Alexa594-Fluor,pH感受性蛍光物質CypHer5Eに対してpNPPを結合させた5つのpNPP-プローブを合成した。これらのpNPP-プローブを用い、生細胞上での一段階分子標識を行った。さらに、発現や精製が困難なリガンド蛋白質(Dkk1やsemaphorin)に着目し、微量に発現した未精製の発現培養上清を用いるだけで、生細胞上に発現させた受容体(結合パートナー)との相互作用を簡便に検出することを可能にした。実際に取り組んだ実験を以下に示す。(1)細胞膜表面に発現している膜蛋白質LRP6の標識と、LRP6細胞内在化の時間追跡(2)LRP6とそのリガンド分子Dkk1との相互作用解析と、変異体を用いた相互作用ドメインの同定(3)Semaphorinファミリー蛋白質の受容体Plexinや補助受容体Neuropilinに対する結合解析(4)Semaphoring-Plxin間結合を検出するハイスループットスクリーニングアッセイ系の確立(5)抗体産生ハイブリドーマ細胞培養上清のスクリーニング法の確立

本課題研究は生理的な条件での分子間相互作用や細胞応答を解析し、その分子構造を見ることを目指している。すなわち、生細胞上で起こる実際の分子の変化を目で見られるようにするものである。そのために、cutinaseという真菌由来セリンプロテアーゼ様酵素およびその自殺型基質p-nitrophenylphosphonate(pNPP)を用い、標的蛋白質を部位特異的かつ共有結合的に標識する方法の開発に取り組んできた。初年度であった昨年度は、cutinase融合蛋白質を用いた受容体-リガンド結合を検出するために、種々の"pNPP-プローブシリーズ"の作製から取り掛かり、ビオチン,蛍光物質Alexa488-,Alexa546-,Alexa594-Fluor,pH感受性蛍光物質CypHer5Eに対してpNPPを結合させた5つのpNPP-プローブを合成した。これらのpNPP-プローブを用い、生細胞上での一段階分子標識を行った。さらに、発現や精製が困難なリガンド蛋白質(Dkk1やsemaphorin)に着目し、微量に発現した未精製の発現培養上清を用いるだけで、生細胞上に発現させた受容体(結合パートナー)との相互作用を簡便に検出することを可能にした。実際に取り組んだ実験を以下に示す。(1)細胞膜表面に発現している膜蛋白質LRP6の標識と、LRP6細胞内在化の時間追跡(2)LRP6とそのリガンド分子Dkk1との相互作用解析と、変異体を用いた相互作用ドメインの同定(3)Semaphorinファミリー蛋白質の受容体Plexinや補助受容体Neuropilinに対する結合解析(4)Semaphoring-Plxin間結合を検出するハイスループットスクリーニングアッセイ系の確立(5)抗体産生ハイブリドーマ細胞培養上清のスクリーニング法の確立