原子レベルでの病態解明に向けたハイスループットな分子間相互作用解析法の開発

転移交差飽和法は、分子量無限大の蛋白質複合体に対して、その界面残基を精密に同定する核磁気共鳴(NMR)測定法である。転移交差飽和法を膜タンパク質-ペプチドリガンド間の相互作用系に対して適用するための、最適条件(膜タンパク質の可溶化条件、膜タンパク質-ペプチドモル比、化学交換速度、溶媒の軽水/重水率、飽和方法・飽和時間、等)の探索を行なった。題材としては、Streptomyces lividans由来のカリウムチャネルKcsAとカリウムチャネル阻害ペプチドAgitoxin2を用いた。カリウムチャネルKcsAとカリウムチャネル阻害ペプチドAgitoxin2の発現には大腸菌による大量発現系をもちいた。また、NMR測定に用いるAgitoxin2は、最小培地により、15Nおよび重水素で均一標識をおこなった。さらに、(転移)交差飽和法をタンパク質-糖鎖間相互作用系、タンパク質-核酸間相互作用系に対して適用するための、最適条件(タンパク質-リガンドモル比、化学交換速度、溶媒の軽水/重水率、飽和方法・飽和時間、等)の探索を行なった。題材としては、CD44細胞外ドメインとヒアルロン酸(2糖の繰り返しからなる多糖)(タンパク質-糖鎖間相互作用系)、インテインとその認識DNA配列(タンパク質-核酸間相互作用系)を用いた。ヒアルロン酸は、不均一高分子多量体であるので、酵素により重合度のそろった分子を得る方法の確立を目指した。

転移交差飽和法は、分子量無限大の蛋白質複合体に対して、その界面残基を精密に同定する核磁気共鳴(NMR)測定法である。転移交差飽和法を膜タンパク質-ペプチドリガンド間の相互作用系に対して適用するための、最適条件(膜タンパク質の可溶化条件、膜タンパク質-ペプチドモル比、化学交換速度、溶媒の軽水/重水率、飽和方法・飽和時間、等)の探索を行なった。題材としては、Streptomyces lividans由来のカリウムチャネルKcsAとカリウムチャネル阻害ペプチドAgitoxin2を用いた。カリウムチャネルKcsAとカリウムチャネル阻害ペプチドAgitoxin2の発現には大腸菌による大量発現系をもちいた。また、NMR測定に用いるAgitoxin2は、最小培地により、15Nおよび重水素で均一標識をおこなった。さらに、(転移)交差飽和法をタンパク質-糖鎖間相互作用系、タンパク質-核酸間相互作用系に対して適用するための、最適条件(タンパク質-リガンドモル比、化学交換速度、溶媒の軽水/重水率、飽和方法・飽和時間、等)の探索を行なった。題材としては、CD44細胞外ドメインとヒアルロン酸(2糖の繰り返しからなる多糖)(タンパク質-糖鎖間相互作用系)、インテインとその認識DNA配列(タンパク質-核酸間相互作用系)を用いた。ヒアルロン酸は、不均一高分子多量体であるので、酵素により重合度のそろった分子を得る方法の確立を目指した。