Molekulare Mechanismen der Hepatitis C Virus-Infektion von Wirtszellen: Analyse Mittels rekombinanter HCV-E1-E2-Dengue Virus Konstrukten

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Ziel des beantragten Projektes ist es, die molekularen Mechanismen zu verstehen, durch die das Hepatitis C-Virus seine Wirtszellen erkennt, bindet und in diese Zellen aufgenommen wird. Im Rahmen unserer Vorarbeiten konnten wir zeigen, dass die initiale Bindung von Dengue Virus, einem dem HCV strukturell eng verwandten Flavivirus, an Hepatozyten über Heparansulfat-Proteoglykane vermittelt wird und von einem 'coated pit'-abhängigen endozytotischen Internalisierungsmechanismus gefolgt ist. Um diese Ergebnisse für HCV zu bestätigen, wurde ein chimärer Flavivirus konstruiert und kloniert, in welchem die Oberflächenproteine von DEN durch die E1-E2-Oberflächenproteine von HCV ersetzt wurden. Erste Ergebnisse zeigen, dass dieser chimäre Virus in Zellkultur repliziert und es zur Synthese von Viruspartikeln kommt. Damit wurde die Limitation umgangen, dass es für HCV immer noch kein Zellkultursystem gibt, mit dem alle Schritte der Virusinfektion untersucht werden können. Selbst die HCV-Replikonsysteme der zweiten Generation führen bisher nicht zur Produktion und Freisetzung von infektiösen Viruspartikeln. Nach einer detaillierten Analyse der strukturellen und biologischen Eigenschaften des chimären HCV-DEN Flavivirus soll dieser als Werkzeug zur Identifizierung HCV-bindender hepatozellulärer Membranmoleküle genutzt werden. Liganden-Blot-Analysen und Screening einer hepatozellulären Expressions-Genbibliothek mit radioaktiv merkierten Viruspartikeln sind die methodischen ansätze zur Realisierung dieses Vorhabens. Speziell entwickelte Assays zur Quantifizierung viraler Internalisierung und die Analyse verschiedener endosomaler Fraktionen mittels konfokaler Lasermikroskopie werden es dann ermöglichen, die Abfolge der initialen Infektionsschritte des chimären HCV-DEN-Flavivirus zu beschreiben.