ビタミンD受容体のユビキチンリガーゼ活性の分子機構解明

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昨年度までに、ビタミンD受容体(VDR)複合体についてVDRの自己ユビキチン化活性を指標に分画し、自己ユビキチン化活性の有する複合体を2つの方法で精製した。これら複合体の構成因子候補として、BEND3及びMYSM1の二因子を同定していた。今年度はこれら因子の機能解析を中心に研究を行い、この結果両者共VDRのビタミンD依存的な転写活性化に寄与することを見出した。まず、BEND3がVDRの転写活性化能に与える影響について解析を行った。具体的な方法としては、過剰発現系及び内在性遺伝子ノックダウン下におけるレポーターアッセイ及び、VDR標的遺伝子の定量的RT-PCRを用いた。まず、内在性VDRによるビタミンD応答が見られないHEK293細胞において、VDR、BEND3を過剰発現してレポーターアッセイを行った結果、BEND3はVDRの転写活性化能を抑制する結果を得た。一方、内在性VDRが機能しているとされるHT-29細胞でBEND3のみ過剰発現して同様の検討を行った結果、この細胞ではBEND3の発現量依存的にVDRの転写活性化能が促進された。BEND3に関する先行研究では、過剰発現させたBEND3がヘテロクロマチンに局在すると言われており(Kizhakke M. et al., J. of Cell Sci., 2011)、HEK293細胞ではこの結果が反映されたと考えられる。一方で、ノックダウンや標的遺伝子発現等、内在性の機能に迫った方法では転写活性化を促進する機能が見られ、内在性BEND3は異なる挙動を示す、乃至は細胞(組織)特異的な作用機構を有すると推測した。MYSM1についても、先に述べたBEND3と同様の方法で解析を行い、MYSM1がVDRの転写活性化能を促進する事を見出した。本結果は、MYSM1についての先行論文(アンドロゲン受容体(AR)の転写を活性化する、Zhu P. et al., Mol. Cell, 2007)を支持する結果であった。さらに、MYSM1についてはMS-MS解析により、このユビキチン化候補サイトを2ヶ所同定した。その内の1つは、MYSM1の脱ユビキチン化活性の酵素中心付近であったことから、MYSM1の酵素活性がユビキチン化により制御される可能性がある。これらの結果により、VDRの転写因子としての作用機序について、他の核内受容体とは異なる面(BEND3)、共通な面(MYSM1)の両面性が示唆された。核内受容体の中ではVDR独自の活性である自己ユビキチン化活性を指標に、リガンド依存的に機能する因子を取得できた事は意義深いと考える。