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ＣｏｌＥ７を用いたアロステリック制御機構を持った人工ヌクレアーゼの開発

使用 ColE7 开发具有变构控制机制的人工核酸酶

基本信息

批准号：
14F04807
负责人：
永田恭介
金额：
$ 1.47万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-25 至 2017-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

近年、遺伝子治療や遺伝子改変技術への応用を視野に入れた人工ヌクレアーゼ（DNA切断酵素）の開発が盛んに行われてきている。しかし、ヒトをはじめとして実際の動物への応用を考えた場合、遺伝子特異性や安全性の面でいまだ多くの課題が残されている。本研究では、大腸菌由来のヌクレアーゼであるコリシンE7（ColE7）をベースとして、アロステリック調節により遺伝子特異的な切断活性を示す新規の人工ヌクレアーゼの開発を目的とした。またゲノムDNAは動物細胞内でヒストンタンパク質との複合体であるクロマチン構造を形成しており、人工ヌクレアーゼの活性に大きな影響を及ぼすと考えられる。そこでクロマチン構造変換因子の一つであるTAF-Iに着目し、TAF-Iによるクロマチン構造変換がDNA切断（損傷）に与える影響の解析を行った。ジンクフィンガー（DNA結合領域）のN末端およびC末端それぞれに、異なるペプチドサイズのColE7のN末端調節領域とC末端ヌクレアーゼドメインを融合したヌクレアーゼを複数デザインした。これらについてコンピュータを用いた分子モデリングを行い、特異的なDNAに結合したときのみヌクレアーゼ活性を示すことが予想されるヌクレアーゼ候補を選別した。これらヌクレアーゼ候補についてそれぞれ大腸菌で組換えタンパク質を作製しDNA切断活性を検討したところ、ColE7のN末端側45アミノ酸とC末端側85アミノ酸の領域の組み合わせで高いDNA切断効率が得られた（論文投稿中）。TAF-Iによるクロマチン構造変換がDNA切断とその細胞応答に与える影響の解析については、TAF-Iの発現を抑制した細胞で、クロマチン動態の低下と薬剤によるDNA損傷が低下する様子が観察され、クロマチン制御因子とDNA切断との関連性について新規の知見が得られた。

In recent years, the technology for the treatment of posthumous disease and the transformation of posthumous disease has been developed using artificial vision technology (DNA-cutting enzyme).しかし、ヒトをはじめとして実间のanimal への応用を考えたoccasions, The specificity and safety of the remaining items are the same as the many problems. In this study, the origin of coliform bacteria is であるコリシンE7 (ColE7) をベースとして, アロThe ステリック regulates the な cutting activity specific to the により缝子 and shows the new regulation of the artificial ヌクレアーゼの开発をpurpose and とした. DNA DNA in animal cells DNA complex DNA complex in animal cells Tectonic ており, Artificial ヌクレアーゼのActivity に大きな Impact を and ぼすと卡えられる. TAF-I TAF-I The analysis of the DNA cutting (damage) and the influence of the DNA structure change and analysis of the DNA.ジンクフィンガー（DNA binding field）のN-terminal およびC-terminal それぞれに、ISO なるペプチドサイズのCo lE7's N-terminal regulatory domain and C-terminal ヌクレアーゼドメインをfusion したヌクレアーゼを plural デザインした. The これらについてコンピュータを uses the いたmolecule モデリングを行い, specific naDNA bindingしたときのみヌクレアーゼACTIVE を Show すことが yu want to されるヌクレアーゼalternate を Select した. ColE 7のN-terminal side 45アアミノacid and C-terminal side 85アミノacidの区のgroupみ合わせでいDNA cutting efficiency is high (thesis is being submitted). TAF-I's structural transformation and DNA cutting and cell cleavage and Analyzing the influence of TAF-I on cells and suppressing TAF-I's effects on cellsチンDYNAMIC ANALYSIS ANALYSIS The control factor and DNA cutting are related to each other and are related to each other.