ゲノム編集ヤギを活用したコンディショナルノックアウトによる排卵制御中枢の解明

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本研究では、ヤギ受精卵におけるゲノム編集により作出したゲノム編集ヤギを用いてキスペプチン遺伝子を視床下部内局所でノックアウト（KO）し、卵胞嚢腫病態モデルの作出に挑戦する。ウシの受胎率低下要因のひとつである卵胞嚢腫は、排卵を調節する視床下部神経機構の機能不全が原因と想定される。本研究では、ヤギをウシのモデル動物として用い、ゲノム編集により作出した卵胞嚢腫病態モデルにより、家畜の排卵制御中枢のメカニズムを解明することを目的とする。本年度は、昨年度に引き続きヤギ受精卵におけるゲノム編集（受精卵エレクトロポレーション（EP））により、ゲノム編集ヤギの作出技術の確立を行った。キスペプチン遺伝子座への外来遺伝子ノックインは成功率が低いことが予想されたため、まず、キスペプチン遺伝子の全身性KOを試みた。ヤギキスペプチン遺伝子のエクソン2領域にガイドRNA（gRNA）を複数設計し、EGxxFPアッセイにより各gRNAの標的配列切断活性を評価して高効率な切断活性を示すgRNAを選定した。選定したgRNAにより、過剰排卵誘起処置を施したヤギから採取した1細胞期胚を用いてゲノム編集を行い、ゲノム編集胚の胚発生率およびゲノム編集胚のジェノタイピングによるゲノム編集率を指標として、最適なEP条件を決定した。最適化したEP条件により1細胞期胚のゲノム編集を行い、得られたゲノム編集胚を発生培養した後に受胚ヤギに移植後、産子（雄1頭）を得た。産子のジェノタイピングにより、片アレルにおいてキスペプチン遺伝子座に5塩基の欠損があるフレームシフト変異が生じていることが明らかとなった（Kiss1ヘテロ変異体）。今後、Kiss1ヘテロ変異体の経時的な体重測定による成長特性評価と、黄体形成ホルモン分泌動態の解析による繁殖機能評価を実施するとともに、交配によりKiss1ホモ変異体（KO個体）を作出する予定である。