オートファゴソーム膜供給機構の解明

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オートファジー必須因子Atg分子の欠損細胞では、オートファゴソームが形成されず、初期構造体や、オートファゴソーム前駆体などの、中間膜構造体が蓄積する。まず、APEXタグを用いた電子顕微鏡解析を行い、初期膜構造体、オートファゴソームの基質、Atg分子、リン脂質合成系酵素の空間的位置関係を、超高解像度レベルで明らかにした。初期構造体が蓄積するサイトには、小胞体様の膜構造、Vesicle状の膜構造、凝集体が観察され、各分子のAPEX依存的なシグナルはそれぞれ特徴的な分布を示した。また、Atg欠損細胞から、オートファゴソーム中間膜構造体の生化学的単離精製に成功した。興味深いことに、オートファゴソーム膜は、初期構造体、隔離膜、閉じたオートファゴソーム膜と成熟していくにつれ、密度が減少し、軽い画分に移行することが分かった。恐らく、オートファゴソーム膜が成熟するにつれ、膜が伸長していくことを反映しているものと考えられる。さらに、中間膜構造体が蓄積した画分から、magnetic beadsを用いて高純度に膜構造体を精製する系の構築も完了し、ただちにプロテオミクス解析、リピドミクス解析を行える準備が整った。局在スクリーニング解析もほぼ完了し、オートファジーに関与する可能性のある脂質輸送タンパク質の候補分子を数分子同定した。すでに以前の解析で単離していた、リン脂質合成系酵素の機能解析も順調に進行している。これまでにCRISPR-Cas9システムを利用し、一つのリン脂質合成系酵素のinducibleなKO細胞の樹立に成功し、現在、オートファジー機能解析を進めている。