大気汚染ガス耐性植物の開発一活性酸素を完全無毒化する新規酵素遺伝子のクローニング

植物には大気汚染ガス成分に由来する有毒な活性酵素をsuperoxide dismutase(SOD)とカタラーゼを用いて無毒化する系がある。これら両酵素遺伝子の発現は細胞内で時間的、空間的に機能的に制御されているため、活性酸素耐性植物の作出は困難である。我々の研究室において、体細胞変異を利用し、除草剤のパラコートに対して耐性のタバコカルスを作出した結果、その中に高いSOD活性が認められた。このSODは単量体であると同時に、カタラーゼ活性ももつ新型のSODであることがわかってきた。本研究では本酵素の遺伝子の単離、構造決定を行い、将来本酵素遺伝子を用いて大気汚染ガス耐性植物を作出するための材料を得ることを目的とし、今年度は本酵素遺伝子のcDNAクローニングのためのプローブ作りを行った。まず、目的酵素を純化した後、トリプシン処理し、得られたペプチドのアミノ酸配列を決定した。アミノ酸配列から対応するコドン配列を推定し、混合塩基の存在するオリゴヌクレオチド(縮重プライマー)を合成した。アダプタープライマーと上記縮重プライマーを用い、パラコート耐性タバコカルスから調製したmRNAを鋳型として3'RACE法によって、cDNAクローンを作製した。6個のcDNAクローンの塩基配列を決定し、上で明らかにしたアミノ酸配列をコードするような遺伝子をもつクローンを選抜した。得られたcDNAクローンから本酵素に特異的な塩基配列をもつ領域を検索し、その領域のみをもつサブクローンプラスミドを得た。来年度は、さらにパラコート耐性タバコカルスから調製したmRNAを鋳型としてcDNAライブラリーから、目的遺伝子の全長cDNAを含むクローンを選抜する予定である。

植物には大気汚染ガス成分に由来する有毒な活性酵素をsuperoxide dismutase(SOD)とカタラーゼを用いて無毒化する系がある。これら両酵素遺伝子の発現は細胞内で時間的、空間的に機能的に制御されているため、活性酸素耐性植物の作出は困難である。我々の研究室において、体細胞変異を利用し、除草剤のパラコートに対して耐性のタバコカルスを作出した結果、その中に高いSOD活性が認められた。このSODは単量体であると同時に、カタラーゼ活性ももつ新型のSODであることがわかってきた。本研究では本酵素の遺伝子の単離、構造決定を行い、将来本酵素遺伝子を用いて大気汚染ガス耐性植物を作出するための材料を得ることを目的とし、今年度は本酵素遺伝子のcDNAクローニングのためのプローブ作りを行った。まず、目的酵素を純化した後、トリプシン処理し、得られたペプチドのアミノ酸配列を決定した。アミノ酸配列から対応するコドン配列を推定し、混合塩基の存在するオリゴヌクレオチド(縮重プライマー)を合成した。アダプタープライマーと上記縮重プライマーを用い、パラコート耐性タバコカルスから調製したmRNAを鋳型として3'RACE法によって、cDNAクローンを作製した。6個のcDNAクローンの塩基配列を決定し、上で明らかにしたアミノ酸配列をコードするような遺伝子をもつクローンを選抜した。得られたcDNAクローンから本酵素に特異的な塩基配列をもつ領域を検索し、その領域のみをもつサブクローンプラスミドを得た。来年度は、さらにパラコート耐性タバコカルスから調製したmRNAを鋳型としてcDNAライブラリーから、目的遺伝子の全長cDNAを含むクローンを選抜する予定である。