酵母を利用したV(D)J組換え機構の解析

利用酵母分析V(D)J重组机制

• 批准号: 08877027
• 负责人: 川市 正史
• 金额: $ 0.77万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08877027/
• 关键词: RAG-1; RAG-2; V(D)J組換え; 2重鎖DNA切断反応; 酵母内反応; シャトルベクター

ヒトのRAG-1とRAG-2遺伝子を誘導的に発現できる酵母株を樹立するため、酵母MET遺伝子プロモーターの下流にRAG-1とRAG-2cDNAをそれぞれ組み込んだプラスミドpYR01とpYR02を構築した。このプラスミドを接合型の異なる酵母にそれぞれ導入し安定な形質転換体株を作成した。V(D)J型組換えの検出用ベクターとして、2μ複製開始点とLeu2マーカーを含む大腸菌/酵母シャトルベクターにV(D)J組換えのシグナル配列とクロラムフェニコール(Cam)耐性遺伝子を組み込み、逆転型の組換えが起これば、Cam耐性となるプラスミドpHK01を構築した。組換えを受けないpHK01は大腸菌内ではアンピシリン(Amp)耐性を示すが、組換えによりAmp耐性に加えてCam耐性となるため組換えを検出できる。まず、pYR01とpYR02を組み込んだ酵母株を接合させ、両方の遺伝子を持つDiploidを作成した。このDiploid株にpHK01を形質転換し、同時にMETプロモーターを誘導するため、無メチオニン培地に酵母をまきなおして24時間後と48時間後に酵母からプラスミドを回収した。このプラスミドを大腸菌に導入し、一部はAmp培地で、残りはAmp/Cam培地で培養し、V(D)J型組換えの成否を検討した。その結果、16万個のAmp耐性大腸菌のうちAmp/Cam培地で増殖する大腸菌は全く検出されず、V(D)J型組換えは起こらないか、あるいは10^5以下の低頻度でしか起こらないことが明かとなった。このため、V(D)J組換えの部分反応が酵母内で起こっているかを確認するため、シグナルに依存した2重鎖DNA切断反応についてLigation-mediated PCRを用いて検討中である。

The RAG-1 and RAG-2 cDNA fragments were induced in yeast strains, and pYR01 and pYR02 were constructed in yeast strains. The mutant yeast was introduced into the stable mutant strain. V(D) J-type transformation is used for detection, and Leu2 replication start point is used for detection. V(D) J-type transformation is used for detection, and Leu 2 replication start point is used for detection. PHK01 is resistant to E. coli. P. is resistant to E. coli. The yeast strains were combined with the yeast strains and the yeast strains were separated into two groups: pYR01 and pYR02. The Diploid strain pHK01 was transformed qualitatively, and the MET was induced simultaneously. The yeast was cultured 24 hours later and 48 hours later. This paper discusses the introduction of E. coli, the cultivation of Amp/Cam, V(D) J-type transformation. As a result, 160,000 Amp-resistant E. coli were cultured in the medium. The total number of E. coli was detected. The V(D) J-type group was replaced with a low frequency of less than 10^5. A partial reaction of the V(D) group was initiated in yeast and confirmed. A dependent DNA fragment was isolated from the DNA fragment by Ligation-mediated PCR.