酵母を利用したV(D)J組換え機構の解析

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ヒトのRAG-1とRAG-2遺伝子を誘導的に発現できる酵母株を樹立するため、酵母MET遺伝子プロモーターの下流にRAG-1とRAG-2cDNAをそれぞれ組み込んだプラスミドpYR01とpYR02を構築した。このプラスミドを接合型の異なる酵母にそれぞれ導入し安定な形質転換体株を作成した。V(D)J型組換えの検出用ベクターとして、2μ複製開始点とLeu2マーカーを含む大腸菌/酵母シャトルベクターにV(D)J組換えのシグナル配列とクロラムフェニコール(Cam)耐性遺伝子を組み込み、逆転型の組換えが起これば、Cam耐性となるプラスミドpHK01を構築した。組換えを受けないpHK01は大腸菌内ではアンピシリン(Amp)耐性を示すが、組換えによりAmp耐性に加えてCam耐性となるため組換えを検出できる。まず、pYR01とpYR02を組み込んだ酵母株を接合させ、両方の遺伝子を持つDiploidを作成した。このDiploid株にpHK01を形質転換し、同時にMETプロモーターを誘導するため、無メチオニン培地に酵母をまきなおして24時間後と48時間後に酵母からプラスミドを回収した。このプラスミドを大腸菌に導入し、一部はAmp培地で、残りはAmp/Cam培地で培養し、V(D)J型組換えの成否を検討した。その結果、16万個のAmp耐性大腸菌のうちAmp/Cam培地で増殖する大腸菌は全く検出されず、V(D)J型組換えは起こらないか、あるいは10^5以下の低頻度でしか起こらないことが明かとなった。このため、V(D)J組換えの部分反応が酵母内で起こっているかを確認するため、シグナルに依存した2重鎖DNA切断反応についてLigation-mediated PCRを用いて検討中である。