セリンプロテアーゼ、S8の阻害による関節炎発症抑制の検討

通过抑制丝氨酸蛋白酶S8抑制关节炎发作的研究

• 批准号: 12877021
• 负责人: 川市 正史
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12877021/
• 关键词: セリンプロテアーゼ; TGF-βファミリー; 変形性骨関節炎; コラーゲン; 細胞外期質; フォリスタチン様蛋白質; 関節炎モデル動物; 軟骨細胞; フォリスタチン様ドメイン; セリン蛋白質分解酵素; 蛋白質分解酵素阻害剤

(1)正常と関節炎のマウス骨組織におけるS8の発現様式:ウサギで作製した抗マウスS8抗血清をアフィニティーカラムで精製したところ、非常に特異的かつ高感度にS8蛋白質を検出できる抗体が得られた。この抗体による免疫染色の結果、出生後の骨組織ではS8は蛋白質はまず二次骨化中心に現れ、やがて骨基質と関節軟骨の深部の軟骨細胞に検出された。抗コラーゲン抗体とLPSを注射して関節炎を発症させたモデルマウスの関節では、誘導後にS8の発現領域が関節軟骨の深部から浅部へと拡大し、慢性期では関節軟骨表面の破壊部位周囲にS8蛋白質の強い沈着が見られ、関節炎発症との強い関連が示唆された。(2)抗ヒトS8モノクローナル抗体の作製:ヒトに関節炎の診断と治療を目指し、ヒトのS8に対するIgGモノクローナル抗体を作製した。この抗体を用いてヒト関節の切片を免疫染色したところ、マウスと同様に、関節軟骨細胞に発現が観察された。この抗体を腹水化し大量に産生することに成功した。(3)S8とTGF-βファミリー増殖因子との結合とシグナル伝達阻害:昆虫細胞とbaculovirusベクターを用いて、マウスS8蛋白質及び各種のS8変異体蛋白質を産生する系を確立し、精製することに成功した。この蛋白質を用いて、S8と種々のTGF-βファミリーとの結合及びシグナル伝達への効果を検討したところ、S8は多様なTGF-β蛋白質と広く結合しそのシグナル伝達を阻害する極めてユニークな活性を持つことが明らかになった。また、TGF-βとの結合にはプロテアーゼドメインが関与することを明らかにした。(4)S8のプロテアーゼ活性:上記の精製S8蛋白質は蛋白分解活性を保持しており、これをもちいて、S8の自己消化及びカゼイン分解活性を検討し、適切な切断断片を得る条件を設定した。(5)S8とコラーゲンC-末プロペプチドの結合:S8は蛋白質相互作用に関るPDZドメインを持つため、このドメインに結合する蛋白質を探索し、各種コラーゲンのC-末プロペプチドと結合していることを明らかにした。C-末プロペプチドは、細胞外基質に蓄積しその合成を調節するシグナル因子として働くなど、細胞外基質の機能と密接に関連した生理活性をしており、S8も細胞外基質の合成制御に関る可能性が示唆された。以上の結果の一部は、2001年7月の国際発生生物学会で発表され、論文の投稿準備中である。

(1) Normal and arthritis bone tissue におけるS8の発appear様style: ウサギでproduced したanti-マウスS8 antiserum をアフThe ィニティーカラムでpurified したところ, the very specific かつhigh-sensitivity にS8 protein を検出できるantibody られた. The results of the immunostaining of the antibody and the secondary ossification center of the postnatal bone tissue, the secondary ossification center of the postnatal bone tissue, the cartilage cells in the deep part of the articular cartilage, and the results. Anti-Glare Antibodies and LPS Injection, Arthritis, Arthritis, Arthritis, Articular Arthritis, Post-Induction Arthritis, Articular Cartilage, Articular Cartilage, and Articular Cartilage, Post-Induction The superficial part is large and the surface of the articular cartilage is damaged in the chronic phase. The S8 protein is strong and the S8 protein is concentrated. (2) Production of anti-Toro S8 モノクローナル antibody: Diagnosis and treatment of Tono arthritis The treatment of the disease is the production of the S8 に対するIgG モノクローナルantibody をした. Antibodies were used to immunostain sections of joints and articular cartilage cells. Antibodies have been successfully produced in large quantities due to the formation of ascites. (3) S8 and TGF-β ファミリーproliferation factor との binding とシグナル伝 blocks: insect cells baculovirus ベクターをUsing いて, マウスS8 protein and various のS8 variant proteins, the する system has been established and refined successfully.このprotein を use いて, S8 と kind 々のTGF-βファミリーとの combination and びシグナル伝大への effect を検 Discussion したところ, S8はTGF-β protein binding resistance Harmful and active.また, TGF-βとの合にはプロテアーゼドメインが关 and することを明らかにした. (4) S8 protein activity: the above-mentioned purified S8 protein and proteolytic activity are maintained, and the activity is maintainedちいて, S8's self-digestion and びカゼイン decomposition activity を検し, appropriate cutting な cutting fragments をget る condition を setting した. (5)S8 とコラーゲンC-last プロペプチドの combination: S8 はprotein interaction に关るPDZ ドメインをhold つため, このドメインにcombinationするproteinをExplorationし、Various コラーゲンのC-last プロペプチドとcombination していることを明らかにした. C-end プロペプチドは, extracellular matrix accumulation and synthesis を regulating factor として卍くなど, extracellular matrix The function and function of the substance are closely related, the physiological activity is closely related, and the synthesis control of the extracellular matrix of S8 is controlled, the possibility is indicated, and the possibility is indicated. The above results are part one, published by the International Society of Biology and Biology in July 2001, and the paper is in preparation for submission.