分子進化工学による多糖分解酵素の耐アルカリ性化

通过分子进化工程研究多糖降解酶的耐碱性

• 批准号: 09875199
• 负责人: 中村 聡
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Tokyo Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09875199/
• 关键词: キシラナーゼ; 耐アルカリ性; 分子進化工学; 枯草菌; 好アルカリ性細菌

β-1,4-キシランは陸上植物細胞壁中に多く含まれる多糖であり,単糖であるD-キシロースがβ-1,4一結合を介して鎖状に連なった構造をとる.キシランのβ-1,4一結合を加水分解する酵素がキシラナーゼである.本研究では,枯草菌が生産するキシラナーゼAの分子進化工学による耐(好)アルカリ性化を目的としている.キシラナーゼA遺伝子の好アルカリ性細菌における発現効率の向上を目的として,Bacillus sp.41M-1株キシラナーゼJ遺伝子のプロモーター・シグナル領域を連結したキメラキシラナーゼ遺伝子を構築し,Bacillus sp.C125株およびBacillus OF4株における発現を試みた.しかしながら,これら二種の好アルカリ性細菌が形成するハローは明確なものではなく,分子進化工学のための宿主としては不適当と判断された.そこで,大腸菌宿主とフィルターアッセイを組み合わせた方法により,分子進化工学実験を行うこととした。キシラナーゼ遺伝子へのランダム変異の導入には,修復能を欠損した大腸菌XL-1 Red株を用いた。変異導入およびフィルターアッセイのサイクルを5回繰り返し,アルカリ性および中性で大きなハローを形成するようになった形質転換体を取得した.しかしながら,このクローンに含まれるキシラナーゼ遺伝子領域には変異箇所は認められず,プラスミドコピー数の増加に伴う生産量の向上が原因であることが明らかとなった.すなわち,XL-1Red株を用いたランダム変異導入の効率は低く,キシラナーゼA構造遺伝子のみならず,ベクターやプロモーター領域に対しても変異を誘発してしまうという欠点が顕在化した.最後に,PCRを利用した変異導入方法について検討を進めた.その結果,目的とする変異導入率を達成することができた.

Beta - 1, 4 - キ シ ラ ン は onshore に く more in plant cell walls contain ま れ る polysaccharide で あ り, 単 sugar で あ る D - キ シ ロ ー ス が beta 1, 4 a combination を referrals し て lock に even な っ た tectonic を と る. キ シ ラ ン の beta 1, 4 a combination を hydrolytic decomposition す る enzyme が キ シ ラ ナ ー ゼ で あ る. This study で は, hay bacterium が production す る キ シ ラ ナ ー ゼ A の molecular evolution technology に よ る resistance (good) ア ル カ リ sexualising を purpose と し て い る. キ シ ラ ナ ー ゼ A good son but 伝 の ア ル カ リ bacterial に お け る 発 の を up now working rate と し て, Bacillus Sp. 41 m - 1 strain キ シ ラ ナ ー ゼ J posthumous son 伝 の プ ロ モ ー タ ー · シ グ ナ ル field を link し た キ メ ラ キ シ ラ ナ ー ゼ heritage 伝 を build し, Bacillus sp. C125 strains お よ び Bacillus OF4 strains に お け る 発 を now try み た. し か し な が ら, こ れ ら two good の ア ル カ リ が form bacteria す る ハ ロ ー は clear な も の で は な く, molecular evolution technology の た め の host と し て は inappropriate と judgment さ れ た. そ こ で, coliform host と フ ィ ル タ ー ア ッ セ イ を group み close わ せ た method に よ り, engineering be on molecular evolution See を lines う とと とと た た. キ シ ラ ナ ー ゼ posthumous son 伝 へ の ラ ン ダ ム - different の import に は, can repair を owe loss し た coliform を Red XL - 1 strain with い た. - different import お よ び フ ィ ル タ ー ア ッ セ イ の サ イ ク ル を 5 back Qiao し り return, ア ル カ リ sex お よ び neutral で big き な ハ ロ ー を form す る よ う に な っ た form quality planning in body を obtain し た. し か し な が ら, こ の ク ロ ー ン に containing ま れ る キ シ ラ ナ ー ゼ heritage 伝 sub-fields に は - different は to recognize a place め ら れ ず, プ ラ ス ミ ド コ ピ ー の Raised に with う production requirement by の が upwards reason で あ る こ と が Ming ら か と な っ た. す な わ ち, XL - 1 red strains を with い た ラ ン ダ ム - different import の sharper rate low は く, キ シ ラ ナ ー ゼ A tectonic heritage 伝 son の み な ら ず, ベ ク タ ー や プ ロ モ ー タ ー field に し seaborne て も - different を 発 lure し て し ま う と い う points less が 顕 in turn し た. Finally に, PCR を using し た - different import method に つ い て beg を 検 into め た. そ の as a result, the purpose と す る を - different import rate reach す る こ と が で き た.

项目成果

Ryousuke Mizui: "Amino Acid Substitutions at the Subunit Interface Cause Thermal Stabilization in IPMDH of Bacillus coagulans" Nucleic Acids Symposium Series. 39. 203-204 (1998)

Ryousuke Mizui：“亚基界面的氨基酸取代导致凝结芽孢杆菌 IPMDH 的热稳定性”核酸研讨会系列。