MAP kinase特異的阻害剤スクリーニング系の確立

MAP kinase特異的阻害剤スクリーニング系の確立に関する研究を行い、以下の結果を得た。酵素現としては、細胞内シグナル伝達機能解析に用いられるPC12細胞を用い、それより増殖因子で刺激し、MAP kinaseを始めとする細胞内シグナル伝達物質が活性化された状態にあるcell lysate及び、増殖因子で処理していないcell lysateの2種類を調製した。次に基質としては、MAP kinaseの良い基質となるMBP(Myerin Basic protein)を、活性型アフィニティー担体リガンド固定化用ゲルに固定化したものを用いた。さらにリン酸化反応を、上記のcell lysate、MBP-アフィニティー担体ゲル複合体、[g-^<32>P]ATP及び、阻害剤を含んだ形で96穴マルチウェルプレート上で行った。反応終了後、96穴マルチウェルプレート用セルハーベスターを用いて、リン酸化されたMBP-アフィニティー担体ゲル複合体のみをガラスフィルター上にトラップし、そのリン酸化放射活性を96マルチウェルプレート用シンチレーションカウンターを用いて測定した。そして、活性化されたcell lysateによるMBPのリン酸化量から、活性化されていないcell lysateによるリン酸化量を減算した値をMAP kinase活性とした。上記の方法を採用することによって、MAP kinase特異的阻害剤検出系の概略を構築することに成功した。今後、既知のkinase阻害剤を用いることにより、本スクリーニング系の検証を行う予定である。

MAP kinase特異的阻害剤スクリーニング系の確立に関する研究を行い、以下の結果を得た。酵素現としては、細胞内シグナル伝達機能解析に用いられるPC12細胞を用い、それより増殖因子で刺激し、MAP kinaseを始めとする細胞内シグナル伝達物質が活性化された状態にあるcell lysate及び、増殖因子で処理していないcell lysateの2種類を調製した。次に基質としては、MAP kinaseの良い基質となるMBP(Myerin Basic protein)を、活性型アフィニティー担体リガンド固定化用ゲルに固定化したものを用いた。さらにリン酸化反応を、上記のcell lysate、MBP-アフィニティー担体ゲル複合体、[g-^<32>P]ATP及び、阻害剤を含んだ形で96穴マルチウェルプレート上で行った。反応終了後、96穴マルチウェルプレート用セルハーベスターを用いて、リン酸化されたMBP-アフィニティー担体ゲル複合体のみをガラスフィルター上にトラップし、そのリン酸化放射活性を96マルチウェルプレート用シンチレーションカウンターを用いて測定した。そして、活性化されたcell lysateによるMBPのリン酸化量から、活性化されていないcell lysateによるリン酸化量を減算した値をMAP kinase活性とした。上記の方法を採用することによって、MAP kinase特異的阻害剤検出系の概略を構築することに成功した。今後、既知のkinase阻害剤を用いることにより、本スクリーニング系の検証を行う予定である。