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MAP kinase特異的阻害剤スクリーニング系の確立

MAP激酶特异性抑制剂筛选体系的建立

基本信息

批准号：
08760117
负责人：
松浦信康
金额：
$ 0.7万
依托单位：
Toyama Prefectural University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08760117/
关键词：
MAP kinase スクリーニング阻害剤

项目摘要

MAP kinase特異的阻害剤スクリーニング系の確立に関する研究を行い、以下の結果を得た。酵素現としては、細胞内シグナル伝達機能解析に用いられるPC12細胞を用い、それより増殖因子で刺激し、MAP kinaseを始めとする細胞内シグナル伝達物質が活性化された状態にあるcell lysate及び、増殖因子で処理していないcell lysateの2種類を調製した。次に基質としては、MAP kinaseの良い基質となるMBP(Myerin Basic protein)を、活性型アフィニティー担体リガンド固定化用ゲルに固定化したものを用いた。さらにリン酸化反応を、上記のcell lysate、MBP-アフィニティー担体ゲル複合体、[g-^<32>P]ATP及び、阻害剤を含んだ形で96穴マルチウェルプレート上で行った。反応終了後、96穴マルチウェルプレート用セルハーベスターを用いて、リン酸化されたMBP-アフィニティー担体ゲル複合体のみをガラスフィルター上にトラップし、そのリン酸化放射活性を96マルチウェルプレート用シンチレーションカウンターを用いて測定した。そして、活性化されたcell lysateによるMBPのリン酸化量から、活性化されていないcell lysateによるリン酸化量を減算した値をMAP kinase活性とした。上記の方法を採用することによって、MAP kinase特異的阻害剤検出系の概略を構築することに成功した。今後、既知のkinase阻害剤を用いることにより、本スクリーニング系の検証を行う予定である。

MAP kinase-specific inhibition factors were investigated and the following results were obtained. Enzyme activity, intracellular protein function analysis, cell lysate activation, and cell lysate activation. The secondary matrix, MAP kinase, and MBP(Myerin Basic Protein) were used for immobilization. In addition, the above mentioned cell lysate, MBP-<32>1, ATP, and inhibitor are included in the 96-point structure. After the reaction, the activity of MBP-96 was determined by the reaction of MBP-96 and MBP-96. The activity of MBP in cell lysate was decreased. The method described above was successfully applied to the construction of a MAP kinase-specific inhibitor detection system. In the future, the use of known kinase inhibitors will be determined.