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新規螢光標識ATPを使ったミオシンATP結合ポケットの“動き"の研究

使用新型荧光标记 ATP 研究肌球蛋白 ATP 结合袋的“运动”

基本信息

批准号：
08680710
负责人：
平塚寿章
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Asahikawa Medical College
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08680710/
关键词：
モーター蛋白質ミオシン螢光標識 ATPの結合構造変化

项目摘要

筋肉が収縮するためにはミオシン頭部がATPを加水分解して得た化学エネルギーを力学エネルギーに変換しなければならない。しかし現在のところこのエネルギー変換に必要なミオシンのATP結合ポケットの“動き"については不明な点が多く残されている。分子の一部に有用な螢光団が標識されているが、ATP本来の生物活性はほとんど元のままに残されている螢光標識ATPは筋肉のエネルギー変換機構の研究に非常に役に立つ。今回ミオシンに対して天然のATPと同じように使用でき、ATP加水分解反応を直接測定できる三種類の螢光標識ATPを開発した。これらの標識物では7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル(NBD)基とピレン(Pyr)の各螢光団がATP分子の糖部分に標識されている。NBD-ATPでは糖部分から螢光団までのアームが長いもの(NBD5-ATP)と短いもの(NBD2-ATP)の二種類を開発した。これらの螢光標識ATPは、ミオシンによりATPとほぼ同じように加水分解された。対応するADP標識物もミオシン頭部あたり1モルが、天然のADPと同じように0.5〜1.3μMの解離定数で結合した。NBD5-ATPとNBD2-ATPを480nmで励起すると540nm付近に螢光を発した。一方Pyr-ATPを360nmで励起すると400nm付近に螢光を発した。NBD5-ATPとPyr-ATPの螢光はミオシンによる加水分解反応中は一度消光され、反応終了後はほぼ元の値に回復した。一方、NBD2-ATPの螢光変化の様子はこれらと全く逆に、加水分解中は増加した。これらの螢光変化をモニターすることにより加水分解速度を直接測定することができた。得られた速度定数は0.06〜0.08s^<-1>で、ATPの値(0.06s^<-1>)とほぼ同じであった。以上の結果から、これら三種類の新規螢光標識ATPはミオシンに対してATPの代わりに使用可能で、加水分解速度を螢光変化から直接測定でき、螢光団が結合しているアームの長さを変えると、ATP結合ポケットの中の異なる領域の動きを捉えることが可能であることが明らかになった。

The muscles are compressed, and the ATP is hydrolyzed to produce a chemical reaction. In addition, the ATP binding mechanism of the ATP binding mechanism is also discussed in detail. A part of the molecule is labeled with fluorescence, and the intrinsic biological activity of ATP is studied in detail. Three kinds of fluorescent labeling ATP have been developed for the direct determination of ATP by using ATP hydrolysis reaction. The fluorescent groups of the 7-NBD group and Pyr group are identified by the sugar moiety of ATP molecule. NBD-ATP has two kinds of fluorescent molecules: NBD5-ATP and NBD2-ATP. The fluorescent label ATP, ATP For ADP markers, the number of dissociations is 0.5 ~ 1.3μM. NBD5-ATP and NBD2-ATP are excited at 480nm and emit fluorescence near 540nm. Pyr-ATP excitation at 360nm and fluorescence emission at 400nm NBD5-ATP and Pyr-ATP fluorescence in the first degree of extinction in the hydrolysis reaction, the end of the reaction in the second degree of extinction One side, NBD2-ATP fluorescence conversion of the son of the reverse, hydrolysis of the reverse increase This allows the fluorescence change to be monitored so that the hydrolysis rate can be directly measured. The speed of the engine is determined by 0.06 ~ 0.08s^<-1>, ATP is determined by 0.06s ^, ATP is determined by 0s ^, ATP is determined by 0.06s^, ATP is determined by 0.06<-1>The above results show that the three kinds of new fluorescent labels ATP can be used directly, the decomposition rate of ATP can be measured directly, the fluorescence can be combined with ATP, and the movement of ATP can be detected in different fields.