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ミオシン頭部の構造変化を利用したATPase反応の定量的蛍光イメージング

利用肌球蛋白头部结构变化对 ATP 酶反应进行定量荧光成像

基本信息

批准号：
10175201
负责人：
平塚寿章
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Asahikawa Medical College
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10175201/
关键词：
モータータンパク質ミオシン ATPase 蛍光イメージング

项目摘要

ミオシンをはじめとするモータータンパク質の研究では、エネルギー源であるATPを加水分解する生物活性(ATPase活性)の測定が不可欠である。現在広く行われているミオシンATPaseの活性測定方法では、反応を止めてから生成物の無機リン酸を定量しなければならないので、ATPase反応の進行をリアルタイムに追跡できない。本研究計画では可視域の蛍光を出す非共有結合性色素に的を絞り、将来的には蛍光顕微鏡下でのATPase反応のリアルタイム観察も可能となる方法について検討した。ミオシン頭部(S-1)にはいくつかの疎水性ポケットがあり、ATPase反応に伴ってこれらのポケットが構造変化を受けることが知られている。そこで500〜600nmの蛍光を出す20種類の蛍光色素に的を絞り、この中から目的に合うものを検索した。その結果、細胞の染色色素として使われているナイルレッド(NR)が目的に適していることがわかった。NRは540nmで励起すると660nmに蛍光を出す。さらにS-1に結合すると蛍光極大は620nmヘシフトした。NR存在下のS-1にATPを添加すると、620nmの蛍光強度は元の85%に減少した。しかしATPが加水分解されてADPになると、12%の蛍光強度の増大が見られた。従ってS-1に結合しているNRの出す蛍光の強度変化を測定すると、ATPが加水分解されてADPになるのをリアルタイムで観察できることがわかった。NRはタンパク質などにほとんどダメージを与えない領域に蛍光を出す。さらに蛍光変化の測定条件を工夫すれば感度を上げることも可能なので、このNR法は将来的には蛍光顕微鏡下でのATPase反応の定量的イメージングにも応用可能であることが明らかになった。

ミオシンをはじめとするモータータンパクqualityの research では、エネルギーsource であるMeasurement of ATP hydrolysis and biological activity (ATPase activity) is indispensable. Nowadays, the method for measuring the activity of ATPase and the inorganic reaction products areリン acid を quantification しなければならないので, ATPase reaction をリアルタイムに tracing できない. This research project aims to develop non-shared binding pigments in the visible range and future projects. It is possible to check the ATPase reaction under a microscopic microscope using the method. Mizuno Head(S-1)にはいくつかの疎Water-based ポケットがあり、ATPas e 応に合ってこれらのポケットがstructural変化をReceived けることが知られている.そこで 500~600nm の蛍光を出す 20 kinds of の蛍光に的を twist り, この中から目に合うものを検SO した. The result of the staining of the cells is the dyeing pigment of the cells. NR is a light source of 540nm and a light source of 660nm.さらにS-1 is a combination of すると荍光大は620nm ヘシフトした. In the presence of NR, S-1 ATP was added and the light intensity at 620nm was reduced by 85%.しかしATPがAdd water to decompose されてADPになると, 12% of the light intensity of の盍大が见られた.従ってS-1に Combined しているNRの出す蛍光のIntensity Changing Measurement すると、ATPがAdd water to decompose されてADPになるのをリアルタイムで看できることがわかった. NRはタンパク性などにほとんどダメージを与えない地に蛍光を出す.さらに蛍Measurement conditions for photoresultation and すればsensitivity を上げることもpossible なので、このNR methodはFuture には蛍Quantitative analysis of the ATPase reaction under a light microscope is possible.