植物が独自に獲得したＤＮＡチェックポイント機構の解明

1.　SOG1リン酸化サイトの同定：SOG1の5ヶ所のSQのうち、2ヶ所（2SQ）、3ヶ所（3SQ）、4ヶ所（4SQ）がSQで、その他はAQに変異させたコンストラクトを作製し、DNA損傷に応答したリン酸化を調べた。その結果、5つのSQ部位はすべてリン酸化されており、またそれらは同時にリン酸化されるのではなく、段階的にリン酸化されることが明らかになった。2.　SOG1リン酸化の意義の検討：2SQ→3SQ→4SQとリン酸化部位が増えるにつれ、DNA損傷に応答した修復遺伝子の転写誘導は野生型と同じレベルに回復することを示した。しかし、根の伸長に関しては4SQであってもSOG1の機能を全く回復しなかった。この結果はSOG1のリン酸化レベルとSOG1の機能回復が必ずしも相関しないことを意味し、各SQ部位のリン酸化はDNA損傷応答経路を決定する役割があることを示した。3.　新規DNAチェックポイント因子の探索：DNA損傷に応答してSOG1と相互作用する因子を共免疫沈降法と質量分析によって同定した。さらにSOG1と発現部位が同じであること、DNA損傷によって発現が上昇すること、Yeast-two-hybrid法によっても結合が確認された、という条件によっても候補因子をさらに絞り込んだ。4.　DNAダメージによって誘導されるプログラム細胞死の発生メカニズムの解析：SOG1のリン酸化変異体である、3SQ変異体では、根での細胞死が野生型SOG1と同じ程度に誘導できるが、4SQでは細胞死が生じている植物体と、生じない植物体が半々の頻度で出現した。この結果は、430番目のSQがリン酸化されることで、細胞死を抑制する別のスイッチが活性化しやすくなることを意味しているのではないかと考えた。

1.　SOG1リン酸化サイトの同定：SOG1の5ヶ所のSQのうち、2ヶ所（2SQ）、3ヶ所（3SQ）、4ヶ所（4SQ）がSQで、その他はAQに変異させたコンストラクトを作製し、DNA損傷に応答したリン酸化を調べた。その結果、5つのSQ部位はすべてリン酸化されており、またそれらは同時にリン酸化されるのではなく、段階的にリン酸化されることが明らかになった。2.　SOG1リン酸化の意義の検討：2SQ→3SQ→4SQとリン酸化部位が増えるにつれ、DNA損傷に応答した修復遺伝子の転写誘導は野生型と同じレベルに回復することを示した。しかし、根の伸長に関しては4SQであってもSOG1の機能を全く回復しなかった。この結果はSOG1のリン酸化レベルとSOG1の機能回復が必ずしも相関しないことを意味し、各SQ部位のリン酸化はDNA損傷応答経路を決定する役割があることを示した。3.　新規DNAチェックポイント因子の探索：DNA損傷に応答してSOG1と相互作用する因子を共免疫沈降法と質量分析によって同定した。さらにSOG1と発現部位が同じであること、DNA損傷によって発現が上昇すること、Yeast-two-hybrid法によっても結合が確認された、という条件によっても候補因子をさらに絞り込んだ。4.　DNAダメージによって誘導されるプログラム細胞死の発生メカニズムの解析：SOG1のリン酸化変異体である、3SQ変異体では、根での細胞死が野生型SOG1と同じ程度に誘導できるが、4SQでは細胞死が生じている植物体と、生じない植物体が半々の頻度で出現した。この結果は、430番目のSQがリン酸化されることで、細胞死を抑制する別のスイッチが活性化しやすくなることを意味しているのではないかと考えた。