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ナノ開口を用いた高濃度蛍光１分子イメージングによるＲｕｖＢの６量体形成機構解析

利用纳米孔径高密度荧光单分子成像分析 RuvB 六聚体形成机制

基本信息

批准号：
13J02227
负责人：
岩佐拓磨
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13J02227/
关键词：
１分子イメージング DNA組換え RuvB 蛍光1分子イメージング

项目摘要

本研究の目的は、DNAの相同組換えの進行に重要な役割を果たすRuvBタンパク質がHolliday Junction複合体を形成するメカニズムを明らかにすることである。蛍光顕微鏡と蛍光標識RuvBを用いて、Holliday Junction DNAと相互作用するRuvBをリアルタイムでイメージングし、6量体形成のメカニズムを明らかにすることにした。RuvBの6量体形成過程の観察には高濃度(>200 nM)のRuvBの存在が必須である。通常の蛍光1分子イメージングの方法では高濃度での観察ができないため、ガラス上に直径および深さが100ナノメートル程度の穴が空いた「ナノ開口基板」を用いて研究を行うことにした。昨年度はナノ開口の作製法を確立し、機能を保ったままRuvBを蛍光標識することにも成功した。本年度は、RuvAと結合させたHolliday Junction DNAをナノ開口の底部に固定し、そこに蛍光標識RuvBを加え、Holliday Junction DNAとRuvBが相互作用する様子をヌクレオチドがない条件、ADP存在下、ATPgammaS存在下、ADPとATPgammaS存在下の4つの異なるヌクレオチド条件下で観察した。その結果、ADPあるいはATPgammaS存在下でより多くのRuvBがHolliday Junction DNAと相互作用することが解った。これらの結果は、ATPが単にRuvB hexameric ring の形成だけでなく、RuvBがRuvA-Holliday junctionと安定な複合体を形成することに重要な役割を果たしていることを示唆している。

DNA のはの purpose, this study in the same group えのに important な "を cut fruit たす RuvB タンパク qualitative が Holliday Junction complex を form するメカニズムを Ming らかにすることである. 蛍 light 顕 micromirror と蛍 light logo RuvB を with いて, Holliday Junction DNA と interaction する RuvB をリアルタイムでイメージングし, 6 quantity body form のメカニズムを Ming らかにすることにした. The formation process of 6 volumes of RuvB <s:1> 観 observation にに high concentration (>200 nM) <s:1> RuvB <s:1> presence が must である. Usually の蛍 light 1 molecular イメージングの way では high-concentration での観 examine ができないため, ガラスに diameter on および deep さが 100 ナノメートル degree の empty hole がいた "ナノ openings substrate" を with いてを line うことにした. Last year, the をナノ open label manufacturing method を was established, and the を function protection ったままRuvBを蛍 light marking するとにとに <e:1> た was successfully registered た. This year, <s:1>, RuvAと combined with させたHolliday Junction DNAをナノ opening に bottom に fixed <s:1>, そに蛍に蛍に蛍 light marking RuvBを plus え, Holliday Junction DNA と RuvB が interaction する others child をヌクレオチドがない conditions, presence of ADP, ATPgammaS presence, ADP と ATPgammaS の in the presence of 4 つの different なるヌクレオチド conditions で観 examine した. その results, ADP あるいは ATPgammaS presence でより more くの RuvB が Holliday Junction DNA と interaction することが solution った. これらの results は, ATP が単に RuvB hexameric ring の form だけでなく, RuvB が RuvA - Holliday junction と settle な complex を form することに important な "を cut fruit たしていることを in stopping している.