ナノ開口を用いた高濃度蛍光１分子イメージングによるＲｕｖＢの６量体形成機構解析

点击翻译按钮获取中文摘要

本研究の目的は、DNAの相同組換えの進行に重要な役割を果たすRuvBタンパク質がHolliday Junction複合体を形成するメカニズムを明らかにすることである。蛍光顕微鏡と蛍光標識RuvBを用いて、Holliday Junction DNAと相互作用するRuvBをリアルタイムでイメージングし、6量体形成のメカニズムを明らかにすることにした。RuvBの6量体形成過程の観察には高濃度(>200 nM)のRuvBの存在が必須である。通常の蛍光1分子イメージングの方法では高濃度での観察ができないため、ガラス上に直径および深さが100ナノメートル程度の穴が空いた「ナノ開口基板」を用いて研究を行うことにした。昨年度はナノ開口の作製法を確立し、機能を保ったままRuvBを蛍光標識することにも成功した。本年度は、RuvAと結合させたHolliday Junction DNAをナノ開口の底部に固定し、そこに蛍光標識RuvBを加え、Holliday Junction DNAとRuvBが相互作用する様子をヌクレオチドがない条件、ADP存在下、ATPgammaS存在下、ADPとATPgammaS存在下の4つの異なるヌクレオチド条件下で観察した。その結果、ADPあるいはATPgammaS存在下でより多くのRuvBがHolliday Junction DNAと相互作用することが解った。これらの結果は、ATPが単にRuvB hexameric ring の形成だけでなく、RuvBがRuvA-Holliday junctionと安定な複合体を形成することに重要な役割を果たしていることを示唆している。