STRUCTURAL ELUCIDATION OF GASTRIC H+, K+ ATPASE

胃 H , K ATP 酶的结构解析

• 批准号: 6281188
• 负责人: ROBERT REID TOWNSEND
• 金额: $ 3.65万
• 依托单位: UNIVERSITY OF CALIFORNIA, SAN FRANCISCO
• 依托单位国家: 美国
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 美国
• 起止时间: 1998-03-01 至 1999-02-28
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://reporter.nih.gov/project-details/6281188
• 关键词: Mammalia; biomedical resource; drug /agent; proteins; spectrometry; stomach; structural biology

The gastric H+,K+-ATPase is a cation antiporter which consists of a and b subunits with M1 = 94,000 subunits with M1 = 60-80,000, respectively (1). The cloned rat a subunit consists of 1033 amino acids (MW = 114,012) and 5 potential glycosylation sites (2), which have been proposed not to be glycosylated on the basis of their suspected location on the cytoplasmic side of the plasma membrane, the inability to bind to lectin Sepharose columns, and the non-specific staining of the a-subunit with dansyl hydrazine after periodate treatment of gel bands (3). We have recently confirmed that the a-subunit is definitively not glycosylated on the basis of monosaccharide analysis of the electro-blotted band (4). The cloned rat b subunit consists of 294 amino acids (MW = 33,689) with 7 potential N-glycosylation sites (5). The rabbit b subunit stained positively for carbohydrate on SDS gels, bound to wheat germ agglutinin and Ricin A Sepharose columns, changed mobility after treatment with PNGase and was found to contain hexose and hexosamines (3). We found that the b-subunit from rabbit contained a ratio of Gal and GlcNAc to Man which suggested the presence of lactosamine-type oligosaccharides (4). Further, the detection of GalN on the protein after removal of all N-linked oligosaccharides indicated the presence of O-linked structures. The b subunit was found to be devoid of sialic acids, a noteworthy finding since sialyl transferase activity is regio-specific in gastrointestinal tissues (6). We propose to extend these initial studies on the structure of this membrane glycoprotein with the following specific aims. (1) Determine the precise molecular weight of the glycoforms of the b-subunit using matrix-assisted laser desorption MS. (2) Locate the sites of glycosylation through analyses using LC/electrospray MS. (3) Elucidate the oligosaccharide structures and eventually define the ensemble at each eptide locus. Due to glycosylation, the b subunit migrates as a smear by SDS PAGE with an estimated molecular weight of 60-80 kDa. Precise molecular weight determination of the individual glycoforms may enable an estimation of the number of glycosylation sites which are present and provide "global" measurements to direct strategies for the additional structural studies in specific aims2 and 3. The number of the 7 potential N-linked sites which are glysoylated or whether somesites are variably glycosylated is not known. LC/electrospray MS will be used to ascertain which N-linked sites are glycosylated and to locate the O-glycosylated loci. Our third specific aim is to elucidate the oligosaccharide structures. Previous studies, using an HPLC mapping approach, indicated that the enzymatically-released oligosaccharides on the b subunit do not co-elute with any of the commonly found lactosamine or high-mannose oligosaccharides. Using HPLCsingular oligosaccharides will be prepared and their molecular weight determined using MALD-MS. Structures will be deduced using a combination of chemical and enzymatic cleavages and appropriate mass spectrometric analyses available at the Center. 1. Forte, J.G. and Lee, H.C. (1977) Gastroenterology, 73, 921-2. 2. Shull, G.E. and Lingrel, J.B. (1986) J. Biol. Chem. 261, 16788-16791. 3. Okamoto, C.T., Karpilow, J.M., Smolka, A. and Forte, J.G. (1990) Biochim. Biophys. Acta 1037, 360-372. 4. Weitzhandler, M., Kadlecik, D., Avdalovic, N., Forte, J., Chow, D. and Townsend, R.R. accepted J. Biol. Chem. (Feb/Mar) 5. Canfield, V.A., Okamoto, C.T., Chow, D., Dortman, J., Gros, P., Forte, J.G. and Levenson, R. (1990) J. Biol. Chem. 265, 19878-19884. 6. Taatjes, D.J., Roth, J., Weinstein, J., Paulson, J.C. (1988) J. Biol. Chem. 263, 6302-6309.

胃 H+,K+-ATP 酶是一种阳离子逆向转运蛋白，其组成为 a 和 b 亚基，M1 = 94,000 亚基，M1 = 60-80,000， 分别为（1）。 克隆大鼠a亚基由1033个氨基酸组成 酸（MW = 114,012）和 5 个潜在的糖基化位点 (2)，其中 已建议不要根据其糖基化 怀疑位于质膜的细胞质侧， 无法与凝集素琼脂糖柱结合，并且非特异性 高碘酸盐后用丹磺酰肼对 a 亚基进行染色 凝胶带的处理 (3)。 我们最近确认， a-亚基绝对没有糖基化，基于 电印迹条带的单糖分析 (4)。 克隆人 大鼠 b 亚基由 294 个氨基酸组成 (MW = 33,689)，其中 7 个氨基酸 潜在的 N-糖基化位点 (5)。 兔b亚基染色 SDS 凝胶上碳水化合物呈阳性，与小麦胚芽结合 凝集素和蓖麻毒素 A 琼脂糖柱，改变流动性后 用 PNGase 处理，发现含有己糖和己糖胺 （3）。 我们发现兔子的b亚基含有一定比例的Gal 和 GlcNAc 到 Man，表明存在乳糖胺型 低聚糖 (4)。 进一步地，检测蛋白质上的GalN 去除所有 N-连接寡糖后表明存在 O-连接结构。 发现b亚基缺乏 唾液酸，这是一个值得注意的发现，因为唾液酸转移酶活性 在胃肠道组织中具有区域特异性 (6)。 我们建议 将这些初步研究扩展到该膜的结构 具有以下特定目标的糖蛋白。 (1) 确定 b-亚基糖型的精确分子量 基质辅助激光解吸质谱。 (2) 找到站点 通过使用 LC/电喷雾 MS 进行分析来确定糖基化。 (3) 阐明寡糖结构并最终定义 每个肽位点处的整体。 由于糖基化，b亚基 通过 SDS PAGE 迁移为涂片，估计分子量为 60-80 kDa。 精确测定个体的分子量 糖型可以估计糖基化的数量 存在并提供“全球”测量以指导的站点 针对特定目标进行额外结构研究的策略2和 3. 7个潜在的N-连接位点被糖酰化的数量 或者某些位点是否被不同程度地糖基化尚不清楚。 LC/电喷雾 MS 将用于确定哪些 N 连接位点 糖基化并定位 O-糖基化位点。 我们的第三个 具体目标是阐明寡糖结构。 以前的 使用 HPLC 作图方法的研究表明 b 亚基上的酶促释放寡糖不 与任何常见的乳糖胺或高甘露糖共洗脱 寡糖。 使用 HPLC 单一寡糖将 制备并使用 MALD-MS 测定其分子量。 将使用化学和化学的组合来推导结构 酶裂解和适当的质谱分析 可在中心获取。 1. 福尔特，J.G.和李，H.C. (1977) 胃肠病学，73, 921-2。 2. 舒尔，G.E.和林格尔，J.B. (1986) J.Biol。 化学。 261、16788-16791。 3.冈本，C.T.，卡皮洛，J.M.， Smolka, A. 和 Forte, J.G. （1990）生物化学。 生物物理学。 第1037章， 360-372。 4.Weitzhandler, M.、Kadlecik, D.、Avdalovic, N.、Forte， J.、Chow, D. 和 Townsend, R.R. 接受了 J. Biol。 化学。 （二月/三月）5. 坎菲尔德 (V.A.)、冈本 (C.T.)、周 (D.)、多特曼 (J.)、格罗斯 (P.)、福尔特 (Forte)， J.G.和 Levenson, R. (1990) J. Biol。 化学。 265、19878-19884。 6. Taatjes, D.J.、Roth, J.、Weinstein, J.、Paulson, J.C. (1988) J. Biol。 化学。 263、6302-6309。