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ACS Nano | 西安交大研发新型钙/铜纳米平台，通过激活铜死亡/类凋亡/凋亡以抑制肿瘤生长
Highlights
1. 开发了一种新型的中空钙铜双金属纳米平台，用于癌症治疗。
2. 该纳米平台能同时触发多种细胞死亡机制，增强抗癌效果。
3. 在动物模型中显示出显著的肿瘤抑制效果，且具有良好的生物相容性。
近日，“ACS Nano”（IF=15.8）上发表了一篇题为“Hollow Calcium/Copper Bimetallic Amplifier for Cuproptosis/Paraptosis/Apoptosis Cancer Therapy via Cascade Reinforcement of Endoplasmic Reticulum Stress and Mitochondrial Dysfunction”的文章。这篇文章开发了一种中空的钙/铜双金属纳米平台（D@HCC-CuTH），用于通过级联放大内质网应激和线粒体功能障碍来治疗乳腺癌。
研究背景介绍
内质网应激（ER Stress）：内质网是细胞内负责蛋白质合成、折叠和运输的重要细胞器。在癌细胞中，由于未折叠和错误折叠蛋白的积累，ER应激水平较高。
铜死亡是一种由铜离子超载引起的新型细胞死亡方式，涉及线粒体蛋白的异常聚集和铁硫簇蛋白的丢失，导致线粒体应激和细胞死亡。
双金属纳米平台是指含有两种或以上金属元素的纳米结构，它们因其独特的物理化学性质在癌症治疗中显示出巨大潜力。这些平台可以作为药物载体，也可以通过其金属离子的释放来诱导细胞死亡。
研究思路分析
研究技术路线图
01纳米颗粒的设计与表征
①通过调节无定形碳酸钙（ACC）的溶解-再结晶过程，利用磷酸钠（Na3PO4）制备了中空碳酸钙（HCC）纳米颗粒。这些HCC纳米颗粒在水中稳定，且部分碳酸根被磷酸根取代。热重分析显示，HCC中磷酸钙和碳酸钙的含量分别为24%和76%。研究表明，磷酸根介导了空心结构的形成。
②制备一种双金属放大器，利用HCC的较大空腔体积和可渗透壳层，通过简单的混合将双硫仑（DSF）载入HCC中。随后，通过Cu2+和丙酰肼（TPH）的原位配位自组装，在DSF载药的HCC上涂覆Cu2+-TPH配位聚合物（CuT）壳层，并在表面通过静电和配位相互作用装饰TPH修饰的透明质酸（HAT），得到最终放大器D@HCC-CuTH。
③该放大器在生理条件下稳定，能在酸性肿瘤微环境中降解释放药物。它在pH 5.5下能迅速释放Ca2+和Cu2+，并在原位形成CuET。此外，放大器能有效耗尽肿瘤细胞中的GSH，并通过Fenton反应增强•OH的产生，从而放大铜诱导的细胞死亡效果。
02体外细胞实验
①研究发现4T1和MCF-7乳腺癌细胞比正常成纤维细胞L929更有效地内吞D@HCC-CuTH，这归因于透明质酸与这两种癌细胞上高表达的CD44受体的特异性结合。而随着孵育时间的延长，细胞内的钙和铜含量显著增加，表明D@HCC-CuTH能被4T1细胞有效内化并从溶酶体中逃逸。此外，D@HCC-CuTH在体外其细胞毒性与药物浓度呈正相关，且优于单独的DSF和Cu2+处理。
②实验检测显示，D@HCC-CuTH处理的细胞中Ub蛋白表达最高，ER应激标志物p-PERK和p-eIF2α的表达显著增加，CHOP蛋白在细胞核中的积累明显。而使用ER应激抑制剂TUDCA和4-PBA能够减轻D@HCC-CuTH的细胞毒性，进一步证实了ER应激在D@HCC-CuTH介导的细胞死亡中的作用。此外，D@HCC-CuTH显著增加了细胞质和线粒体中的Ca2+水平，而ER应激抑制剂4-PBA预处理能显著降低这些水平，表明D@HCC-CuTH通过放大ER应激和引起线粒体Ca2+超载，从而引发细胞的类凋亡。
③检测发现，D@HCC-CuTH处理的细胞内铜含量显著增加，且能有效消耗细胞内的GSH，增强铜死亡效果。此外，D@HCC-CuTH通过促进线粒体Ca2+超载、TPH介导的GSH耗竭和铜催化的•OH生成，显著增加了细胞内的ROS水平，形成自我放大的循环，与铜死亡协同诱导严重的线粒体功能障碍。D@HCC-CuTH处理的细胞线粒体膜电位下降，ATP生成显著减少，线粒体和内质网的形态变化，证实了线粒体的严重损伤。此外，D@HCC-CuTH通过引发细胞色素c释放和激活caspase-3，促进了细胞凋亡。使用不同的抑制剂，证实了D@HCC-CuTH通过铜死亡、类凋亡和凋亡的协同途径杀死癌细胞。
03体内抗肿瘤效果
①研究发现D@HCC-CuTH纳米平台具有良好的血液相容性。检测其在体内的药代动力学和生物分布，发现其半衰期为6.2h，且在肿瘤组织中能很好的富集。D@HCC-CuTH在肝脏、脾脏和肾脏中也有较高积累，这是由于网状内皮系统摄取所致。活体荧光成像进一步证实了D@HCC-CuTH在肿瘤中的快速积累和长时间保留。
②在4T1肿瘤模型小鼠中进行的抗肿瘤疗效研究显示，D@HCC-CuTH治疗组与其他组相比，肿瘤生长显著抑制，且显著延长了小鼠的生存时间。进一步探索D@HCC-CuTH的抗肿瘤机制，通过免疫荧光染色发现，D@HCC-CuTH治疗组肿瘤中Ub积累和CHOP上调最明显，表明ER应激和类凋亡强烈激活。同时，DLAT聚集和caspase-3表达也最显著，证实了铜死亡和凋亡途径的存在。最后，对D@HCC-CuTH的生物安全性进行了研究，未观察到明显的系统毒性，表明其具有良好的生物相容性和潜在的体内应用前景。
图1. HCC纳米颗粒的制备与形成机制
图2.D@HCC-CuTH的制备与结构
图3. D@HCC-CuTH的特性表征
图4. 细胞摄取与细胞毒性
图5. D@HCC-CuTH放大内质网应激
图6. D@HCC-CuTH诱导线粒体功能障碍
图7. 体内抗肿瘤效果评估
图8. Abstract
结论与讨论
本研究成功构建了一种中空钙铜双金属纳米平台D@HCC-CuTH，通过级联放大内质网应激和线粒体功能障碍，有效诱导乳腺癌细胞经历铜死亡、类凋亡和凋亡三种细胞死亡途径。该纳米平台在体内外均显示出显著的抗肿瘤效果，且具有良好的生物相容性，为多模式癌症治疗提供了新的策略。
未来研究需深入探索其诱导的免疫原性细胞死亡对肿瘤微环境及抗肿瘤免疫反应的影响。此外，还需优化纳米平台的靶向性和药物载荷，以提高疗效并减少潜在的副作用。进一步的临床前和临床研究也是将这一疗法转化为实际应用的关键步骤。