Vasohibin-2による横紋筋肉腫の悪性化制御機構の解明と新規治療法の開発

阐明Vasohibin-2控制横纹肌肉瘤恶性进展的机制并开发新的治疗方法

基本信息

批准号：
21K07089
负责人：
鈴木康弘
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

バキュロウイルスによる蛋白発現系でGFPを付与したVASH2-SVBP複合体とVASH1-SVBP複合体および各種VASH変異体-SVBP複合体蛋白の合成と精製を行い、ポリエチレングリコールを含有するバッファー内における液-液相分離現象を確認したところ、VASHのα-チューブリン脱チロシン化活性を欠損する変異体とVASHのN末端とC末端にある天然変性（disorder）領域を双方とも欠損する変異体においても野生型VASHと同様に液-液相分離を誘導することを確認した。また、VASHのN末側order領域の一部を欠損することによって、VASH-SVBP複合体形成に明確な影響は認められないが、蛋白安定性が減弱する傾向が確認された。NanoLucルシフェラーゼ断片と高い親和性のあるHiBiTタグをC末端に付与した各種VASH2変異体とSVBPを細胞に強制発現させ、細胞が合成するVASH2-SVBP複合体の細胞内蛋白量と培養液中の細胞外分泌量をルシフェラーゼ活性で測定したところ、SVBPとの複合体形成に必要とされるVASH2側のアミノ酸配列に変異を加えることで、野生型と比して変異VASH2の細胞内蛋白量と細胞外分泌量が連動して減少することを確認した。精製VASH2-SVBP 複合体は細胞外刺激性に培養血管内皮細胞の機能に明確な影響を与えなかった。VASH2 mRNAのExon7を標的とするアンチセンスオリゴをヒト胞巣型横紋筋肉腫細胞株に導入することによって、細胞内のVASH2蛋白量が減少し、これに伴いα-チューブリンの脱チロシン化レベルが抑制されることを確認した。

合成并纯化了VASH2-SVBP复合物，VASH1-SVBP复合物和各种Vash突变体-SVBP复合蛋白，并在含有聚乙烯甘油的缓冲液中证实了液 - 液相分离现象。已经证实，在缺乏VASH和突变体的α-微管蛋白驱散活性的突变体中诱导了液态相分离，这些突变体在VASH的N和C末端都缺乏与野生型Vash相同的方式。此外，删除VASH的N末端秩序区域的一部分并不清楚地影响Vash-SVBP复合物的形成，但已证实蛋白质稳定性往往会减弱。各种VASH2突变体和具有HIBIT标签的SVBP对纳米荧光素酶片段具有高亲和力，被迫在细胞中表达它们，并且使用荧光素酶活性测量了由细胞和细胞外介质中细胞外分泌的量和细胞外分泌的量合成的VASH2-SVBP复合物的细胞内蛋白。通过在VASH2侧突变氨基酸序列，这是与SVBP形成复合物所必需的，与野生型相比，细胞内蛋白的量和突变体Vash2的细胞外分泌量与细胞外分泌的量有关。纯化的VASH2-SVBP复合物对细胞外培养的血管内皮细胞的功能没有明显的影响。可以证实，通过将靶向VASH2 mRNA的反义寡素引入人肺泡型横纹肌型肉瘤细胞系中，细胞中VASH2蛋白的量减少，并同时抑制了α-抑制蛋白的驱虫水平。

项目成果

期刊论文数量（7）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

難治がんに対する革新的治療法の開発

开发顽固性癌症的创新疗法

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发表时间：
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影响因子：
0
作者：
通讯作者：

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作者：
Komiyama Makoto;Shigi Narumi;Ariga Katsuhiko;鈴木康弘
通讯作者：
鈴木康弘

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通讯作者：
Masashi Kitagawa