Molekulare Analyse der Diarylheptanoid-Synthase und verwandter Enzyme

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Gegenstand des Projekts sind biochemische und molekularbiologische Arbeiten zur Biosynthese von Diarylheptanoiden. Diese Klasse diverser phenolischer sekundärer Pflanzenstoffe umfasst u.a. lineare, z.B. Curcuminoide, und cyclisierte Strukturen, z.B. Phenylphenalenone. Das in diesem Vorhaben interessierende Enzym katalysiert einen allen diesen Verbindungen wahrscheinlich gemeinsamen frühen Biosyntheseschritt. Dabei wird 4-Cumaroyl-CoA (oder ein anderer Phenylpropanoyl- Starter) mit einem durch eine pflanzliche Polyketidsynthase III (WtPKSI aus Wachendorfia thyrsiflora) synthetisierten Diketid verknüpft. Die geplanten Untersuchungen umfassen eine Doppelstrategie unter (1) Einsatz der konventionellen Proteinreinigung, der zunächst der Nachweis der Enzymaktivität vorausgeht, und (2) Nutzung einer 3-Hybrid-methode für den direkten Zugang zur DNA-Sequenz des interessierenden Proteins. Das Ziel ist die funktioneile Identifizierung des klonierten Proteins nach heterologer Expression in E. coli oder einem anderen geeigneten Expressionssystem, die detaillierte Bestimmung der Enzymeigenschaften sowie die Identifizierung der Produkte. Die funktioneile Expression der Diarylheptanoid-Synthase soll (als Co-Expression mit WtPKSI) auch in Arabidopsis erfolgen. Als pflanzliche Objekte sind Wurzelkulturen von Wachendorfia thyrsiflora (Haemodoraceae) und evtl. andere Arten aus DiaryIheptanoid-produzierenden Familien vorgesehen.