Molecular mechanism of epithelial sheet formation and its repair through the tight junction

上皮片层形成及其通过紧密连接修复的分子机制

• 批准号: 21H02684
• 负责人: 米村 重信
• 金额: $ 11.23万
• 依托单位: The University of Tokushima
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21H02684/
• 关键词: 上皮シート; タイトジャンクション; 損傷修復; ミオシン; バリア機能; 張力; ZO-1

タイトジャンクション形成に関するシグナリングに関して、シグナル分子である三量体Gタンパクのαサブユニットに含まれる、G12alpha, G13alpha,がTJ形成に重要という報告が最近なされた。これまでG12alpha,, G13alpha,の活性化はその下流でミオシンを活性化させ、ストレスファイバー形成を促すと考えられてきた。これはミオシンの活性化がTJ形成に重要であることを示唆する。G12alpha,, G13alpha,の活性がTJ機能を阻害するという報告もあるので、状況は複雑だが、一方、DLD-1細胞ではカドヘリン接着を阻害してもさらにミオシン活性を阻害することでTJ形成が促進されるという結果を私たちは得ている。このあたりの矛盾を明らかにして、TJ形成におけるミオシンの役割を理解するため、G12alpha,, G13alpha,についてsiRNAによるノックダウンを試み、DLD-1細胞ではTJ形成が著しく阻害されることを確認した。市販のG12alpha,, G1alpha,抗体に関しては、細胞染色では核などへの非特異的反応が強いものの、TJ付近への集積も認められた。ミオシンによる張力と上皮シート修復との関係を明らかにするために、修復時に細胞表面蛋白質に対する抗体をコートした磁気ビーズを細胞表面に付着させ、その磁気ビーズをネオジム磁石で引っ張り、特定方向の力を与えるという実験を新たに行った。細胞には蛍光ミオシンを発現させており、修復時に形成されるアクトミオシンリングを追跡して修復の程度をモニターするというライブイメージングによって解析を行なった。傷害の穴が広がる方に力がかかった方が、修復のスピードが速いという興味深い結果が出ている。

关于紧密连接形成的信号传导，最近据报道，信号分子三聚体G蛋白的α亚基中包含的G12alpha和G13alpha对于TJ形成很重要。到目前为止，人们一直认为G12alpha和G13alpha的激活会在下游激活肌球蛋白，并促进压力纤维的形成。这表明肌球蛋白激活对于TJ形成很重要。这种情况很复杂，因为有报道称G12alpha和G13alpha的活性抑制了TJ功能，但我们已经实现了抑制DLD-1细胞中钙粘蛋白粘附的进一步抑制肌球蛋白的活性，从而促进TJ的形成。为了阐明这种差异并了解肌球蛋白在TJ形成中的作用，我们试图用siRNA击倒G12alpha，G13alpha，并确认在DLD-1细胞中TJ形成显着抑制。关于市售的G12alpha，G1alpha和抗体，细胞染色显示出对核和其他物质的强烈非特异性反应，但在TJ附近也观察到积累。为了阐明肌球蛋白诱导的张力与上皮片修复之间的关系，我们进行了一个新的实验，在修复过程中，将涂有抗细胞表面蛋白的抗体的磁珠连接到细胞表面，并用磁珠将磁珠拉动，并用新的磁铁磁体使它们在特定方向上给它们提供一个力。细胞表达荧光肌球蛋白，并通过实时成像进行分析，该成像跟踪修复过程中形成的肌动球蛋白环并监视修复程度。有趣的发现表明，施加到损伤孔扩展的部分的力是修复的速度更快。

项目成果

大腸上皮細胞のin vitro基底膜形成における近接線維芽細胞由来IV型コラーゲンの寄与

近端成纤维细胞衍生的 IV 型胶原对体外结肠上皮细胞基底膜形成的贡献

• 发表时间: 2022
• 作者: 栗栖 修作;天宅 あや;米村 重信
• 通讯作者: 米村 重信

アクチンフィラメントの流れと上皮細胞頂底極性形成との関係

肌动蛋白丝流与上皮细胞顶端极性形成的关系

• 发表时间: 2022
• 作者: 柴田 桂太朗;米村 重信
• 通讯作者: 米村 重信